Bradford 方法

1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法(Bradford法)，是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。 

一、原理：

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合，在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。

Bradford法的突出優點是:

(1)靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質-染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。

(2)測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。

(3)干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

此法的缺點是:

(1)由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。

(2)仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有:去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣)。

(3)標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。

二、試劑與器材1.試劑:(1)標準蛋白質溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質溶液。(2)考馬斯亮蘭G-250染料試劑:稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。2.器材:(1)可見光分光光度計 (2)旋渦混合器 (3)試管16支

三、操作方法

1.標準方法

(1)取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標準蛋白質溶液給各試管分別加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G-250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。

(2)加完試劑2~5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A595，空白對照為第1號試管，即0.1mlH2O加5.0mlG-250試劑。注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。

(3)用標準蛋白質量(mg)為橫座標，用吸光度值A595為縱座標，作圖，即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。2.微量法當樣品中蛋白質濃度較稀時(10-100mg/ml)，可將取樣量(包括補加的水)加大到0.5ml或1.0ml，空白對照則分別為0.5ml或1.0ml H2O，考馬斯亮藍G-250試劑仍加5.0ml，同時作相應的標準曲線，測定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。

Folin—酚試劑法（Lowry法）

一、實驗原理

這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。

這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。

這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。進行測定時，加Folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發生，故當Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。

 二、試劑與器材

1.試劑

（1）試劑甲：

（A）10克Na₂CO₃，2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉（KNaC₄H₄O₆·4H₂O）。溶解于500毫升蒸餾水中。

（B）0.5克硫酸銅（CuSO₄·5H₂O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。

（2）試劑乙：

在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na₂WO₄·2H₂O）,25克鉬酸鈉（Na₂MoO₄·2H₂O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結束時，加入150克硫酸鋰（Li₂SO₄），50毫升蒸餾水及數滴液體溴，開口繼續沸騰15分鐘，以便驅除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。

（3）標準蛋白質溶液:精確稱取結晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。

2.器材

（1）可見光分光光度計

（2）旋渦混合器

（3）秒表

（4）試管16支

三、操作方法

1.標準曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標準蛋白質溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標準曲線。注意：因Lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。進行多試管操作時，為了防止出錯，必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量（微克）和測得的吸光度值。

2.樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質20~250微克），按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起，同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。根據所測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應的蛋白質量，從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。注意，由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度（相對于標準蛋白質）。

二喹啉甲酸法(BCA法)

一、實驗原理

BCA檢測法是Lowry測定法的一種改進方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡單，試劑更加穩定，幾乎沒有干擾物質的影響，靈敏度更高（微量檢測可達到0.5μg/ml），應用更加靈活。蛋白質分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡合生成絡合物，同時將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結合生成深紫色的化合物，這種穩定的化合物在562nm處具有強吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質的含量。

二、實驗材料  

1.實驗器材 721分光光度計；恒溫水浴槽；移液管；微量進樣器；試管架和試管。 

2.實驗試劑

(1) BCA試劑的配制

① 試劑A，1L：分別稱取10g BCA (1%)，20g Na₂CO₃·H₂O (2%)，1.6g Na₂C₄H₄O₆·2H₂O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO₃ (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO₃調節pH值至11.25。

② 試劑B，50ml：取2g CuSO₄·5H₂O (4%)，加蒸餾水至50ml。

③ BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩定一周。

(2)標準蛋白質溶液：稱取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。

(3)樣品溶液：配制約50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。

三、實驗操作

1.繪制標準曲線 標準曲線的繪制：取試管七支、編號，按下表操作：

混勻，37℃保溫30min，用562nm比色，測定吸光度值

2．實驗結果 根據樣品的吸光值從標準曲線上查出樣品的蛋白質含量。

四、該方法的優點

(一) 操作簡單，快速，45分鐘內完成測定，比經典的Lowary法快4倍且更加方便；

(二) 準確靈敏，試劑穩定性好，BCA試劑的蛋白質測定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測定范圍在0.5-10μg/ml。

(三) 經濟實用，除試管外，測定可在微板孔中就進行，大大節約樣品和試劑用量；

(四) 抗試劑干擾能力比較強，如去垢劑，尿素等均無影響 。