概述

　　在反相液相色譜中，死體積附近往往會形成一個或一些正的或者倒的色譜峰，這些色譜峰獨立于樣品而存在，可以統稱這些色譜峰為系統峰。一般地，系統峰的產生與所使用的色譜柱，流動相添加劑以及起始有機相的比例有關。從經典色譜塔板理論出發，流動相經泵混合經由管路系統引入到色譜柱內，流動相內的所有組分，均會在固-液兩相之間分配，直到平衡。而當樣品或者其他與起始流動相組成比例不同的溶液被注入色譜柱的時候，色譜柱頭部的各物質的分配平衡被干擾，每種物質的平衡狀態被干擾之后再次回復到平衡狀態的過程中，也就產生了系統峰，檢測到的系統峰的種類與多少和采用的檢測器的種類有關(如一些鹽離子在紫外檢測器上無法被檢測到，卻可以被CAD檢測器檢測到)。

　　如下圖1所示，流動相為ACN：Water=4：96，添加劑TFA的濃度為0.1%，進樣溶劑組成為ACN：Water=4.4：95.6，添加劑TFA的濃度為0.1%。圖中的正負色譜峰即為典型的系統峰。

　　反相液相色譜系統峰的影響因素

　　如前所述，反相色譜系統中，系統峰的形成與色譜柱，流動相的組成特別是添加劑的種類以及濃度有關，此外配置樣品的溶劑的組成也是十分重要的因素。如下圖2A所示，流動相的組成為乙腈與純水，添加劑為1：1的1,5-二氯蒽醌與1,8-二氯蒽醌，進樣溶液為與流動相比例相同的乙腈與純水；圖2B所示，流動相的組成為乙腈與純水，進樣溶液為1：1的1,5-二氯蒽醌與1,8-二氯蒽醌溶液。

　　由上圖2A與圖2B，1,5-二氯蒽醌與1,8-二氯蒽醌在兩張色譜圖中互為鏡像，此外區別還在與圖2A與圖2B中的兩個色譜峰的峰面積的絕對值的差異。上述現象，亦可說明反相液相色譜系統峰的形成與流動相的組成以及樣品溶劑組成之間具有密不可分的關聯。

　　又如下圖3所示，流動相為乙腈-水體系，流動相中還添加有另外兩種添加劑，濃度分別為0.001 M，采用等度洗脫模式。該圖可以更加直觀地呈現多種添加劑存在的反相液相色譜中系統峰變化的概況。

　　一般地，當我們對樣品進行分析的時候，優先使用流動相溶解或者稀釋樣品，盡可能地減少由溶劑引起的一些不良的色譜現象(如溶劑效應等)，此外也能夠減小進樣操作對于色譜平衡狀態的干擾程度。但在醫藥工藝以及藥物分析過程中，醫藥中間體以及終產品多含有酸/堿官能團，為了獲得優異的色譜峰峰形，流動相中往往會添加有機酸堿添加劑甚至需要使用不同種類、不同pH的緩沖鹽作為添加劑。由于各種添加劑的使用，導致流動相的組成比較復雜，且各組成成分在色譜柱固定相以及流動相之間分配并達到平衡。

　　為了充分減少溶劑組成與流動相的組成不同引起的諸如溶劑效應等一系列問題，我們會盡可能的使用流動相作為溶劑，但有的時候，待分析化合物對于酸或者堿性環境不穩定，這時為了保證樣品分析時效內的穩定性，不可避免地要使用與流動相不同的溶劑來溶解樣品。除此之外，一些難溶性的樣品，有時候會使用到DMSO或者DMF作為助溶劑，而與此同時，我們不可能在流動相中添加這些助溶劑，這也導致溶解樣品的溶劑與流動相的組成不同的情形。

　　以上，我們也只是針對等度洗脫模式進行的討論，而對于梯度洗脫模式，流動相中的各種組成成分的分配平衡過程就要復雜的多。因此系統峰的出現，基本不可避免，特別是使用酸堿等具有強紫外吸收的添加劑，緩沖鹽以及離子對試劑的時候。

　　反相液相色譜系統峰的個數

　　一般地來說，按照反相液相色譜系統峰理論，反相液相色譜流動相的組成為N的話，如果檢測器允許，將可檢測到N-1個系統峰，而系統峰的正負，與檢測手段有關。

　　如下圖所示，流動相組成為乙腈：水=4：96，其中添加TFA，濃度為0.1%；樣品為空白，其組成為乙腈：水=4.4：95.6，其中添加TFA，濃度為0.1%。從下圖中，我們看到有四個色譜峰，依次為死體積處色譜峰，溶解氧色譜峰，TFA與乙腈的疊加色譜峰以及添加劑TFA引起的空穴效應倒色譜峰。

　　此外，從圖中也可以看出，TFA與乙腈的疊加色譜峰面積的絕對值要大于添加劑TFA引起的空穴效應倒色譜峰面積的絕對值，其原因也顯而易見，在扣除乙腈所引起的色譜峰面積之后，二者面積的絕對值，在理論上講，應該是一致的。

　　如上圖實例，流動相中有水，乙腈，TFA以及溶解氧，共四種組分，而在色譜圖上卻只看到2個色譜峰(最后一個為空穴效應倒色譜峰)。這是由于TFA在普通的C18色譜柱上容量因子較小，基本不能做到較有效的保留，引起與乙腈色譜峰的重疊，導致實際觀察到的系統色譜峰個數減少的現象。

　　反相液相色譜系統峰的形成的理論解釋

　　按照色譜塔板理論，將色譜柱等效為有限元個塔板，溶質在各塔板內均要達到分配平衡，經過適當演化，可得到下述兩個數學模型，如下圖5。

　　其中，mm為平衡時流動相中的溶質質量，k’為溶質的容量因子，ms為平衡時固定相中的溶質質量，mtotal為總質量；上角標t為任一時刻，下角標i為任一塔板。

　　假設流動相的組成為乙腈與水，其中添加0.1%的TFA，使用前經超聲處理，將上述模型做以改變，如下圖6所示

　　在這里，首先假定乙腈在很小的變化范圍內的時候，其分配系數維持常數，而TFA的分配系數則與乙腈的濃度呈現線性相關的關系。按照上述模型進行計算機模擬，流動相組成為乙腈：水=4：96，添加劑為0.1%的TFA。

　　如上圖7A所示，紅色為進樣乙腈：水=4.4：95.6，含有0.1%TFA的空白溶液，藍色為進樣乙腈：水=4.4：95.6，綠色為乙腈：水=4：96，添加劑為0.1%的TFA；上圖7B則為，紅色為進樣乙腈：水=3.6：96.4，含有0.1%TFA的空白溶液，藍色為進樣乙腈：水=3.6：96.4，綠色為乙腈：水=4：96，添加劑為0.1%的TFA。

　　上圖7A與7B的區別在于乙腈引起的色譜峰的正負性以及TFA的色譜峰及其引起的空穴效應色譜峰的先后關系。其中圖7A與圖4的實際色譜狀況完全一致。

　　此外也可直觀地對上述模擬結果進行解釋，如對于圖7A，進樣溶液的乙腈的組成比流動相的組成要高0.4%，由于一定的小范圍內乙腈的分配系數近似于常數，高濃度的乙腈色譜帶經色譜柱后形成正色譜峰。對于TFA，雖然進樣溶液與流動相中的濃度均為0.1%，但是TFA的分配系數隨乙腈濃度的變化而線性改變，當高濃度的乙腈溶液被注入色譜柱之后，由于該色譜帶的乙腈濃度高，TFA在固定相內的分配相應減少而導致檢測器處檢測到正峰，在該進樣色譜帶之后，乙腈的濃度得到重新恢復，固定相中的TFA的分配勢必得到增加，在檢測器處形成空穴效應倒峰，如果仔細比較可以發現二者的紫外吸收光譜互為鏡像。

　　如前所述，TFA基本不被C18色譜柱保留的特性，導致出峰位置與乙腈重合，可以使用PFBA作為相應的添加劑，其他條件不變，對系統峰進行指認(PFBA能夠被有效保留)，如下圖8所示。

　　P1色譜峰為乙腈色譜峰，P2色譜峰為PFBA色譜峰，P3為溶氧色譜峰，P4為PFBA引起的空穴效應的倒峰，且其面積的絕對值與PFBA色譜峰面積的絕對值相等。

　　以上為等度模式下，系統峰所具有的特點及其形成原因。在梯度模式下就相對比較復雜了。與等度模式下一樣，同樣與色譜柱的類型以及流動相的組成以及配樣溶液的組成有很大的關系。一般地，對于強紫外吸收的添加劑，隨著梯度的運行，早期色譜圖上多會形成一個比較突出的色譜平臺或鼓包。

　　反相液相色譜中的系統峰，一般是獨立于樣品而存在的，其形狀及形成的原因與流動相的組成，色譜柱的類型以及配制樣品所用的溶劑有關。系統峰的形成，可按照經典色譜塔板理論輔助計算機模擬進行解釋，也可以根據分配-平衡進行簡單描述。然而，在梯度洗脫模式下，系統峰的形狀以及形成原因還與梯度的斜率以及方法前平衡時間的長短有關。