前言

流式細胞術(shù)是一種對快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選的技術(shù)，具有檢測速度快、測量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點，已經(jīng)成為近代科學研究中的熱門專題，研究它的論文數(shù)量也在逐年上升。流式細胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）是以流式細胞術(shù)為核心技術(shù)，集光學、電子學、流體力學、細胞化學、生物學、免疫學以及激光和計算機等多門學科和技術(shù)于一體的先進科學技術(shù)設(shè)備。它被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學、細胞學、生物學、微生物學、制藥學、生殖學等領(lǐng)域，是現(xiàn)代科學研究中的先進儀器之一，被譽為實驗室的"CT"。

1 流式細胞儀的工作原理和技術(shù)指標

1.1 流式細胞儀工作原理

圖1為流式細胞儀基本結(jié)構(gòu)。它主要有四部分組成：流動室和液流系統(tǒng)；光源與光學系統(tǒng)、信號收集與信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、計算機與分析系統(tǒng)。具有分選功能的流式細胞儀還包括分選系統(tǒng)。將待測細胞熒光染色后制成單細胞懸液，在鞘液的包被下單行排列，依次通過流動室檢測區(qū)域。以激光作為激發(fā)光源，垂直照射檢測區(qū)域的樣品流，被熒光染色的細胞在其照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，它們同時被前向光電二極管和側(cè)向90°方向的光電倍增管接收。前向小角度的光散射信號（forward scatter,FSC）反映了細胞體積的大小；側(cè)向90°方向的光散射信號（side scatter，SSC）反映了細胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜情況。激發(fā)熒光信號代表了所標記的被測細胞內(nèi)部顆粒的信息。這些光信號轉(zhuǎn)化成電信號，被傳送到計算機，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換器傳輸?shù)轿C處理器形成數(shù)據(jù)文件，保存到計算機上，以備脫機后的數(shù)據(jù)處理和分析。細胞的分選是將待測液滴充以正負不同的電荷，讓其在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入不同的收集容器中，從而實現(xiàn)細胞的分離。

圖 1 流式細胞儀結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 流式細胞儀性能的技術(shù)指標

流式細胞儀性能的技術(shù)指標主要有熒光分辨率、熒光靈敏度、分析參數(shù)多少及分析、分選速度及純度等。熒光分辨率是指分辨兩個相鄰峰的最小距離，通常用變異系數(shù)（CV值）來表示。現(xiàn)在市場上主流型號的熒光分辨率小于2.0%，有的甚至在1%之內(nèi)。熒光靈敏度反映了儀器探測最小熒光光強的能力，一般用熒光微球上可測出的熒光（FITC）的最小分子數(shù)來表示。目前儀器可以達到100以內(nèi)。一般分析速度為500-10000個細胞/s，分選速度控制在1000個細胞/s以下，分選純度>98%,有的儀器（如 MoFLo High-Performance Cell Sorter）分析速度可達100000個細胞/s，分選速度可達70000個細胞/s，分選純度>98%。應(yīng)用方向不同，分析參數(shù)的多少差異較大，少的（如Guava PCA-96）可以分析3個熒光參數(shù)和1個散射信號，多的（如CyFlow SL）可以分析13個熒光參數(shù)和3個散射信號。

2 流式細胞儀的應(yīng)用

2.1 在臨床上的應(yīng)用

細胞癌變過程中伴隨細胞DNA含量的改變，DNA非整倍體細胞是惡性腫瘤的特異性標志。流式細胞儀的FSC能夠給出這些信息，在腫瘤的早期診斷和鑒別診斷中有著很重要的作用；早在80年代人們發(fā)現(xiàn)特定T細胞亞群可以反映AIDS患者的臨床狀態(tài)，而流式細胞儀可以對這些T細胞亞群進行檢測，為AIDS的診斷、治療提供有用信息；流式細胞儀借助于各種熒光染料測定一個細胞的多種參數(shù)完成白血病及淋巴瘤的診斷，準確率達90%左右，較傳統(tǒng)形態(tài)學檢查準確性提高10%-20%；流式細胞儀對淋巴細胞及其亞群數(shù)量的檢測，可以探索疾病的發(fā)病機理、病程、預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療方案。

2.2 在生物學及微生物學上的應(yīng)用

從早期到現(xiàn)在，在細胞及細胞器方面很多已被人們所接受的科技，都經(jīng)流式細胞儀研究過。在細胞功能的早期研究中，研究者僅能通過觀測微生物的吞噬來研究噬中性粒子,而流式細胞儀可以通過它們的大小、形狀、抗體及吞噬過程中微生物種類、數(shù)量的變化更深入的辨別、研究這些噬中性粒子；氧自由基的實時、單細胞繁殖評價，DNA倍體分析，細胞循環(huán)中細胞增殖和凋亡分析等都會用到流式細胞儀；流式細胞儀對細胞周期可以輕松分析，促進了以此為基礎(chǔ)的植物學的發(fā)展，輔以成像儀器，流式細胞儀可以對微生物的成長、繁殖進行3-D研究。

2.3 在生殖學及制藥學上的應(yīng)用

利用對精子DNA進行無害標定的DNA染料(如Hoechst 33342)或H-Y抗體都可以對精子進行檢測和分類，完成生殖學上的要求；FCM檢測腫瘤細胞的耐藥相關(guān)蛋白的表達水平，對檢測臨床腫瘤化療效果及藥物的選擇有一定的意義。此外，流式細胞儀在細胞毒，可溶性蛋白質(zhì)分子，鈣離子濃度檢測等都有很廣泛的用途。此外，流式細胞儀在細胞毒，可溶性蛋白質(zhì)分子，鈣離子濃度檢測等都有很廣泛的用途。

3 流式細胞儀的最新發(fā)展

3.1 儀器功能專業(yè)化

Partec CyFlow、BD FACSCount可以實現(xiàn)CD4,CD8,CD3絕對計數(shù)，用于HIV檢測的經(jīng)濟普及型流式細胞儀。

3.2 儀器全面自動化

免疫標本制備儀、組織樣本制備儀和樣品前處理儀在實驗中得到廣泛應(yīng)用。不同規(guī)格的多孔板或多試管自動進樣器加速了自動化進程。Epics XL、FACSCalibur 等主流廠家儀器都實現(xiàn)了自動化。

3.3 多色多參數(shù)分析迅速發(fā)展，分析、分類速度加快

新興熒光探針的不斷開發(fā)和儀器軟、硬件的逐步更新，流式細胞儀的多色熒光分析得到了迅速發(fā)展，對細胞亞群的識別更準確、更精細。

3.4 儀器小型化

適應(yīng)實際需要的小型化、便攜式流式細胞儀也是一個發(fā)展的趨勢。最近幾年，微流體流式細胞儀成為研究的熱門方向，在這方面的研究也越來越多，取得了一定的科研成果。

3.5 儀器功能增強化

鑒于拉曼光譜易于識別的特點，Dakota A. Watson 等對能夠探測拉曼光譜的流式細胞儀進行了研究，這將使細胞的多參數(shù)測量提升一個檔次。

3.6 理論的新發(fā)展

An-Shik Yang等采用SIMPLEC迭代算法對流式細胞儀液體流動的理論模擬結(jié)果與文獻公布的實驗數(shù)據(jù)吻合很好，為微流體流式細胞儀的流體室設(shè)計提供了理論參考。

另外，試劑盒熒光試劑、液相芯片技術(shù)、定量流式細胞分析、儀器模塊化等也是流式細胞儀的發(fā)展趨勢。

4 未來展望

本文對流式細胞儀的原理、應(yīng)用、發(fā)展現(xiàn)狀和趨勢作了簡明扼要的論述，使科研者和使用者有一個更深刻的了解和認識。隨著科學技術(shù)的進步，流式細胞儀專業(yè)化區(qū)分更加明顯，科研型大型儀器和普及性應(yīng)用儀器成為兩個主流；隨著光電技術(shù)的發(fā)展，相信流式細胞儀能夠在測量多色熒光參數(shù)的時候，給出多參數(shù)分析結(jié)果，同時完成分類，實現(xiàn)實時同步分析的功能，這對臨床醫(yī)療快速診斷意義重大。