一、實驗原理

流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是一種單細胞定量分析技術，該技術通過測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收等參數，可以定量分析細胞的結構特征（如DNA含量、蛋白、細胞膜、胞漿或胞核抗原表達量）和功能特征（如細胞內酶活性、鈣流變化等）等多種重要參數，進行細胞特征分析與分選。它的核心功能是將混合物中的不同細胞分離并計數，將感興趣的細胞分選出來，提供分類比例并進行進一步分析。

二、實驗步驟

（一）樣本制備

1.取樣: 取100μL抗凝血。

2.標記：根據抗體說明書標記實驗管。混勻后，室溫避光孵育15分鐘。

3. 溶血：將10×裂紅液用水稀釋10倍，每管加入1mL，振蕩器混勻后室溫避光靜置10分鐘，300g，4°C離心5分鐘。

4. 洗滌：棄去上清，加入1mL 1×PBS洗液，300g離心洗滌5分鐘，洗2-3次。

5. 上機檢測：棄去上清后加入500μL 1×PBS，混勻懸浮后過濾，避光等待上機檢測。

（二）儀器操作

1. 打開流式細胞儀、開啟液流、質控。

2. 分選前設置：共包含兩個步驟，第一，調節合適的液流斷點，待四路窗口形成清晰的5路液流，其中含4個收集液流，一個廢液流后，利用“sweetspot”鎖住此斷點；然后利用Accudrop 珠子，調整 “Drop Delay”時間，當左側液流接近 100%，而且保持相對穩定的范圍的時間是最佳時間。

3. 設置分析條件：完成質控后，建立用戶文件夾、當日實驗文件夾，根據細胞標記，選擇所需參數，根據各抗原之間生物關系及實驗主要關注點，畫好 FSC-SSC及各熒光參數兩兩相對的散點圖，根據抗原生物關系設置分析門，及群級聯關系表。

4. 確定電壓：先上對照管，根據淋巴細胞在 FSC-SSC散點圖中的位置，調整 FSC和SSC兩個參數的電壓，保證淋巴、單核及中心粒細胞呈現在合適的位置，然后設置P1 門圈住淋巴細胞；根據陰性細胞群位置，調整好其它熒光參數的電壓，記錄10000個細胞。

5. 分類計數：上陽性管，通過分級設門，完成各抗原之間生物關系的呈現，及各細胞分類計數情況。

6. 分選設置：在“sort layout”窗口，設置收集裝置和純度模式，然后設置分選門，圈住CD4或CD8 陽性的細胞，將分選門分別填入左右“sort location field” 框中。

7. 分選：將收集管中分別裝200ul 1XPBS，放入儀器分選倉下面的收集管架上：點“sort”開始分選，此時“sort location field”框中可見所獲得的CD4或CD8陽性的細胞數目；收集到足夠的目的細胞后，停止分選。

8.細胞純度檢測：利用上樣針清洗液和水清洗上樣針，直到以水上樣時，FSC-SSC散點圖中“無點”為止。將分選獲得的CD4陽性細胞上樣回測，觀察細胞分選純度；再次清洗上樣針，將分選獲得CD8陽性細胞上樣回測，觀察細胞分選純度。

三、實驗結果

通過上述步驟，我們可以成功分選并收集到特定的T細胞群體。

分類結果分析：外周血CD8+T細胞在T淋巴細胞中占比：46.7%，外周血CD4+T細胞在T淋巴細胞中占比：36.3%。

分選細胞純度分析：外周血CD8+T細胞在T淋巴細胞中占比：98.3%，不含外周血CD4+T細胞，表明分選成功。