多糖（Polysaccharide）作為天然產(chǎn)物中主要的生物活性物質(zhì)和能量來(lái)源，在過(guò)去的幾十年里受到了廣泛的關(guān)注，大量研究表明天然多糖具有多種生物活性。枸杞、香菇和木耳等來(lái)源多糖被證明具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性。此外，多糖因其特殊的流變性、熱學(xué)和凝膠結(jié)構(gòu)特性而被應(yīng)用于食品、材料和制藥行業(yè)。多糖是由單糖或簡(jiǎn)寡糖縮合而成的多聚物。 植物多糖是植物細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的聚合度超過(guò)10個(gè)的聚糖，不能再水解的糖類統(tǒng)稱為單糖，單糖可以依據(jù)其碳數(shù)的不同分為丙糖、丁糖、戊糖、己糖等，植物中的單糖以己糖（六碳糖）和戊糖（五碳糖）為主，常見(jiàn)的單糖有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖等，單糖的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。 準(zhǔn)確測(cè)定單糖組成對(duì)闡明多糖的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，有助于進(jìn)一步了解其構(gòu)效關(guān)系。

表1 天然多糖中常見(jiàn)單糖的信息

多糖單糖組成分析的難點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:（1）多糖的復(fù)雜性使單糖難以完全分離；（2）不適當(dāng)?shù)乃鈼l件會(huì)導(dǎo)致單糖的降解；（3）單糖結(jié)構(gòu)相似，許多單糖互為外聚體；（4）存在單糖異構(gòu)體的可能性；（5）單糖親水性強(qiáng)；（6）單糖一般缺乏任何固有的熒光或色基。

單糖組成分析，多糖的解聚是第一步，這一步是通常通過(guò)酸水解、酸甲醇水解、物理輔助水解和酶水解進(jìn)行。單糖的回收率與水解程度密切相關(guān)，水解程度受多糖性質(zhì)的影響，如單糖的種類、糖苷鍵的位置和類型以及糖基的各種取代。此外，還應(yīng)考慮檢測(cè)前釋放單糖的穩(wěn)定性。自從紙色譜法20世紀(jì)40年代首次應(yīng)用于測(cè)定碳水化合物，其他的檢測(cè)方法也陸續(xù)出現(xiàn)了，包括薄層色譜、氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）、毛細(xì)管電泳（CE）、高性能陰離子交換色譜（HPAEC-PAD）。以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生-HPLC法測(cè)定單糖組成為例，多糖的單糖組成測(cè)定流程見(jiàn)圖1。

圖1 PMP柱前衍生化-HPLC法測(cè)定單糖組成流程

酸水解是目前最普遍、最有效的多糖解聚方法，主要利用硫酸（H2SO4），三氟乙酸（TFA）和鹽酸（HCl）在加熱條件下水解。水解過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，而如圖2a所示的酸水解反應(yīng)機(jī)理則相當(dāng)復(fù)雜，糖苷鍵的裂解是由糖苷O原子或O環(huán)原子的質(zhì)子化引起的，以形成異位碳正離子。隨后，它可與水反應(yīng)形成α、β-異構(gòu)體單體糖的混合物，并釋放一個(gè)質(zhì)子。環(huán)O原子的質(zhì)子化和/或單體糖的突變可以形成α,β-吡喃糖和α,β-呋喃糖環(huán)形式。一般來(lái)說(shuō)，主鏈上的糖苷鍵比分支鏈上的糖苷鍵更穩(wěn)定；吡喃糖形式的糖苷鍵比呋喃糖形式的糖苷鍵更穩(wěn)定；醛糖形式比酮糖形式更穩(wěn)定；糖醛酸比中性和堿性糖更穩(wěn)定。然而，在苛刻的條件或較長(zhǎng)的處理時(shí)間下，酸水解除了會(huì)導(dǎo)致多糖中糖苷鍵的裂解外，還可能導(dǎo)致釋放的單糖過(guò)度降解。在這種情況下，一些糖可能會(huì)降解為非糖，從而加深反應(yīng)的顏色。因此，確保最佳的水解強(qiáng)度和水解時(shí)間是必不可少的，同時(shí)也需要在單糖的最大解離和最小破壞之間取得微妙的平衡。

圖2 β-D-半乳聚糖酸水解(a)和酸甲醇水解(b)TFA水解是單糖釋放的一種有效方法。TFA在水解后通過(guò)蒸發(fā)很容易被去除，這省去了中和的步驟，造成的損失更少。TFA因其溫和的水解能力而比H2SO4更適合水解果膠，特別是含鼠李糖的果膠。此外，TFA也被作為半纖維素的水解劑。不過(guò)TFA對(duì)纖維素聚合物、粘蛋白多糖的水解能力較弱。

HPAEC、HPLC和GC是目前單糖檢測(cè)的常用分離方法，見(jiàn)圖3。這些平臺(tái)可以與各種檢測(cè)器相結(jié)合，如折射率(RI)紫外線(UV)，脈沖安培檢測(cè)(PAD)，質(zhì)譜(MS)、熒光燈和其他一些探測(cè)器。在實(shí)踐中，研究者們發(fā)現(xiàn)每種方法都有自己的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)和適用范圍。在根據(jù)多糖的特性選擇檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)考慮多糖的性質(zhì)、數(shù)量和實(shí)驗(yàn)條件。即使使用同一臺(tái)儀器，不同檢測(cè)之間的設(shè)備和校準(zhǔn)也存在差異。雖然現(xiàn)有的檢測(cè)分離技術(shù)正在逐步完善，但仍面臨許多問(wèn)題和挑戰(zhàn)。大多數(shù)GC、HPLC技術(shù)由于缺乏顯色或熒光基團(tuán)，往往需要衍生化，可能存在不完全衍生化，造成單糖的損失。HPAEC-PAD具有高靈敏度，不需要衍生化，但PAD不能提供摩爾檢測(cè)器響應(yīng)，為定量測(cè)定必須提供每種分析單糖的標(biāo)準(zhǔn)。因此，開(kāi)發(fā)更多的絕對(duì)定量技術(shù)是單糖成分分析的發(fā)展方向之一。

圖3 HPAEC、HPLC和GC檢測(cè)原理

參考文獻(xiàn)

[1] Liu D , Tang W ,  Yin J Y , et al. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides from natural sources: Hydrolysis condition and detection method development[J]. Food Hydrocolloids, 2021, 116(3):106641.