摘 要： 建立了一種高效液相色譜法，用于食品中4種嘌呤含量的快速、穩定檢測。于90 ℃水浴中，采用高氯酸溶液水解樣品30 min，調節水解液pH值至2.20，然后選用C18色譜柱，以0.7 mL/min流量等度洗脫分離，并在254 nm波長下測定腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤含量。4種嘌呤的質量濃度在0.1～20 μg/mL范圍內與色譜峰面積具有良好的線性關系，相關系數均大于0.999。4種嘌呤加標平均回收率為97.8%~100.6%， 測定結果的相對標準偏差均低于2.0 %（n=7）。實際樣品檢測發現動物性食品中嘌呤含量普遍高于植物性食品，尤其是海鮮和動物內臟，而植物性食品中豆類及其制品含量最高。該方法可為檢測技術的發展和應用提供堅實的科學依據和技術支持。

關鍵詞： 高效液相色譜法； 嘌呤； 樣品預處理； 食品分析

嘌呤是一種廣泛存在于食物中的生物堿，分子結構由一個嘧啶環和一個咪唑環稠合而成，常見的種類包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤及其衍生物等，是人體新陳代謝的關鍵產物，參與構成遺傳物質和能量物質。然而，長期攝入高嘌呤食物，加上生活不規律，可能導致尿酸鹽沉積，引發腎關節炎、腎臟疾病、結石和痛風[1-2]。正常人體血漿尿酸含量為200～410 μmol/L，男性偏高于女性，當超過 420 μmol/L（男性）、357 μmol/L（女性）時被認為是高尿酸血癥，也就是痛風的無癥狀形式[3]。嘌呤主要通過體內代謝、核酸分解和食物獲取，其中食物是主要的外源途徑。嘌呤在食物中以游離態和化合態存在，化合態嘌呤主要以嘌呤堿基的形式存在[4]。目前常用的食物中嘌呤檢測方法包括高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法以及離子對交換法等[1]，其中最具普適性的是高效液相色譜法中的反相色譜法，該方法簡單、快速、靈敏度高，能實現準確的檢測。為了進一步優化嘌呤的檢測過程，筆者對食物樣品處理步驟進行了改進，避免了傳統方法中常見的沉淀、萃取和濃縮等復雜步驟，簡化了實驗流程，減少了樣品損失和誤差，從而提高了檢測的準確性。此外，分別對色譜柱、流動相、流量等關鍵參數進行了細致的優化，使得嘌呤的檢測結果更為準確和靈敏。通過對多種食物樣品的檢測，驗證了該方法在實際應用中的有效性和可行性。該方法旨在通過優化樣品前處理步驟和液相色譜檢測條件，提高嘌呤檢測的準確性和效率，為該檢測技術的發展和應用提供堅實的科學依據和技術支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，配紫外檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

pH計：FE28型，梅特勒托利多科技（中國）有限公司。

電子天平：(1) Quintix124-1CN型，感量為0.1 mg；(2) Quintix35-1CN型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多科技（中國）有限公司。

恒溫數顯水浴鍋：HH-4型，溫控范圍為室溫～100 ℃，力辰科學儀器（湖南）有限公司。

腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標準物質：純度（質量分數）大于99.7%，標準物質編號分別為78472-100 mg，75526-100 mg，75762-1 g，75793-10 mg，北京壇墨質檢科技有限公司。

甲醇：色譜純，西隴科學股份有限公司。

四丁基氫氧化銨：分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司。

磷酸二氫鉀、高氯酸、氫氧化鉀：均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

食品樣品：市售，其中水產品類包括油貝、蝦肉、蝦肉、沙丁魚、羅非魚；畜禽肉類包括豬肉、羊肉、牛肉、雞肉、鴨肉；內臟類包括雞心、雞腎、豬肝、豬肚、鴨心；蔬菜類包括白菜、油麥菜、豆芽、韭菜、茄子、西紅柿、馬鈴薯；菌菇類包括金針菇、海鮮菇、鮮香菇；調味品類包括雞精、蠔油、醬油、牛肉湯；濃湯寶類包括豬骨湯、老母雞湯；豆類：紅豆、黃豆、綠豆；干制品類包括蝦米干、云耳、紫菜、腐竹；酒類包括啤酒、RIO、真露。每種樣品5份共計205份，采購后于4 °C下避光保存，備用。

1.2 溶液配制

混合標準儲備溶液：分別準確稱取10.0 mg腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤標準物質，用5 g/L的氫氧化鉀溶液溶解并定容于20 mL容量瓶中，得到質量濃度均為500 μg/mL的混合標準儲備溶液。

混合標準中間溶液：準確移取混合標準儲備溶液 2.00 mL于20 mL容量瓶中，用5 g/L 氫氧化鉀溶液定容，得到 50.0 μg/mL 的混合標準中間溶液。

系列混合標準工作溶液：移取適量50.0 μg/mL混合標準中間溶液，用5 g/L 氫氧化鉀溶液配制成4種嘌呤質量濃度均分別為0、0.10、0.50、1.0、5.0、10、20 μg/mL，調節pH值為2.20。

流動相：準確稱取磷酸二氫鉀0.952 0 g，加水約800 mL溶解，依次加入40%四丁基氫氧化銨3 mL和甲醇50 mL，用磷酸調節pH 值至3.00，加水定容至1 000 mL。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：Aglient XDB-C18柱 (250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：26 ℃；流動相：7 mmol磷酸二氫鉀-0.3%四丁基氫氧化銨- 5%甲醇，流量為0.7 mL/min；pH 值：3.00；洗脫方式：等度洗脫；洗脫時長：15 min；進樣體積：10 μL；檢測波長：254 nm。

1.4 實驗步驟

1.4.1 樣品處理取固體樣品約1 g或液體樣品約2 g，置于50 mL離心管中，加10%高氯酸溶液10 mL，于90 ℃水浴30 min，取出，冷卻至室溫，用氫氧化鉀溶液調節pH值至2.20，轉入50 mL容量瓶準確定容，取1 mL過0.22 μm的微孔濾膜，作為樣品溶液。與樣品等質量的5 g/L 氫氧化鉀溶液為空白樣品溶液。1.4.2 定量方法取嘌呤系列混合標準工作溶液、樣品溶液、空白樣品溶液，按照1.3儀器工作條件測定，以色譜峰面積外標法計算4種嘌呤的含量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

2.1.1 色譜柱

色譜柱采用Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美國安捷倫科技有限公司)，其填料采用3種不同類型的多孔硅膠微球，表面鍵合辛基硅烷化學鍵，降低了載碳量，雙封端可以把裸露的硅羥基封閉起來。研究結果表明，該填料可以快速、準確地檢測食物中嘌呤這類極性物質[5?6]。

2.1.2 流動相pH值

VURAN等[7]研究發現液相色譜法分離堿性組分時，用磷酸鹽作為流動相可有效提高分離度，而磷酸鹽的pH值又直接影響緩沖鹽的離子強度，適宜的pH值還可以保證生物活性，所以磷酸二氫鉀可用作食物中嘌呤的洗脫檢測。XDB-C18 色譜柱的硅羥基酸度系數pKa范圍為2.5～4.5，容易吸引堿性化合物，色譜圖易產生拖尾現象，而嘌呤屬于弱堿性物質，因此pH 值的設定需考慮既保持嘌呤活性，又能將其從固定相中分離出來，且具有高的準確度。鳥嘌呤和腺嘌呤的pKb值分別為3.20和4.15，流動相pH值的改變也會對其分離效果產生顯著影響[8?9]。使用稀磷酸調節流動相 pH值分別為 2.60、2.80、3.00、3.20、3.40。當pH值分別為 2.60、2.80時，腺嘌呤有拖尾現象；當pH值分別為 3.20、3.4時，嘌呤組分分離度不夠，檢測準確度降低；當pH值為 3.00時，4種嘌呤組分分離效果及峰形理想。

2.1.3 流動相甲醇含量

流動相僅使用磷酸二氫鉀時，4 種嘌呤色譜保留時間均較長，流動相中的鹽溶液會腐蝕色譜柱填料，降低其使用壽命，加入甲醇既縮短了檢測時間，還能很好地保護色譜柱。嘌呤作為一種極性化合物，在色譜分析中，通過向流動相中引入四丁基氫氧化銨這種離子對試劑，可以與C18色譜柱的固定相發生相互作用。四丁基氫氧化銨在水溶液中電離后，形成了帶正電的季銨陽離子，這種結構能有效與C18色譜柱的硅烷醇基團產生較強的靜電作用。這種相互作用增強了色譜柱對極性嘌呤化合物的保留能力，同時四丁基氫氧化銨可以與嘌呤生成中性離子，增強與非極性相的作用，改善分離效果[6，10]。甲醇可以改變嘌呤與流動相的結合能力，破壞嘌呤物質與配體基間的親和作用，增加流動相的洗脫強度，提高分離準確度[11]。調節流動相的甲醇體積分數分別為1%、3%、5%、7%、9%。隨著甲醇含量的增加，4種嘌呤的出峰保留時間逐漸減小，分離度變小，腺嘌呤峰形拖尾增大。當甲醇含量為5% 時，4種嘌呤組分能在10 min內得到很好的分離且峰形良好。

2.1.4 流動相流量

根據前期試驗結果，選擇流動相為7 mmol磷酸二氫鉀-0.3%四丁基氫氧化銨-5%甲醇，設定流動相流量分別為0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 mL/min。當流動相流量為0.5 mL/min時，黃嘌呤出峰保留時間超過15 min，腺嘌呤峰形呈現前沿峰；當流動相流量為0.7 mL/min時，4種嘌呤組分均能在10 min內得到有效分離，且峰形較好；當流動相流量為0.9 mL/min時，腺嘌呤峰形拖尾；當流動相流量分別為1.0、1.2 mL/min時，次黃嘌呤與腺嘌呤的分離度不夠，無法完全分離。隨著流動相流量的增大，出峰保留時間降低，且分離度下降，各類雜峰難以分開，檢測準確度降低。此外，高流量還會使柱壓升高，損壞色譜柱，縮短其使用壽命，因此采用流動相流量為0.7 mL/min。

2.1.4 色譜圖

在1.3儀器工作條件下，對混合標準工作溶液（10.0 μg/mL）進行測定，色譜圖見圖1。從圖1中可以看出，4種嘌呤在已優化的色譜條件下分離情況良好。

1—腺嘌呤；2—鳥嘌呤； 3—次黃嘌呤； 4—黃嘌呤圖1　10.0 μg/mL混合標準工作溶液色譜圖

Fig. 1   Chromatogram of 10.0 μg/mL mixed standard working solutiont/min

2.2 樣品處理優化

2.2.1 酸種類選擇

目前食物中嘌呤的提取一般采用酸法。酸的種類選擇及用量均對提取效果有顯著影響[12]。分別采用高氯酸、磷酸、乙酸、甲酸、鹽酸對牛肉進行提取，嘌呤測定結果見圖2。從圖2中可以看出，高氯酸溶液和鹽酸溶液消解牛肉，均呈現較好的提取效果，由于高氯酸可以用鉀鹽除去，即使有少量殘留也不會對后續色譜分析產生影響，因此選用高氯酸溶液作為提取溶劑對樣品進行消解提取。

圖2   5種酸提取樣品下嘌呤含量測定結果

Fig. 2   Detection results of purine in samples extracted by 5 acids

2.2.2 高氯酸濃度

FENG等[13]采用最佳酸水解和高效液相色譜法測定預包裝食品中的嘌呤，研究發現高濃度高氯酸會導致嘌呤降解，從而導致回收率降低。試驗采用質量分數分別為5%、10%、15%、20%的高氯酸，分別對牛肉中嘌呤進行提取，結果見圖3。從圖3中可以看出，嘌呤提取含量先上升后下降，10%高氯酸提取效果最好。

圖3   不同高氯酸濃度下嘌呤含量測定結果

Fig. 3   Detection results of purine content under different concentrations of perchloric acid

2.2.3 水解溫度

在嘌呤的提取中，總嘌呤的提取通常采用熱酸法，而冷酸提取法則常用于游離嘌呤的提取。然而，使用熱的酸進行提取時，可能會導致已提取出的游離嘌呤發生分解，進而影響最終測得的總嘌呤含量[14?15]。分別在70、75、80、85、90、95、100 ℃水浴溫度下，采用10%高氯酸對牛肉中嘌呤組分提取，結果見圖4。從圖4中可以看出，在90 ~ 95 ℃的水解溫度范圍內，牛肉中嘌呤能被完全水解；在70 ~ 85 ℃的溫度范圍內，嘌呤水解不充分；在95 ~ 100 ℃的溫度范圍內，腺嘌呤和黃嘌呤的含量顯著下降。綜合考慮水解效率和損失程度，最終確定水解溫度為90 ℃。

圖4   不同水解溫度下嘌呤含量測定結果

Fig. 4   Detection results of purine content at different hydrolysis temperatures

2.2.4 水解時間

檢測結果的準確性受樣品水解程度的影響較大，如果牛肉中核酸物質能完全被水解為游離堿基，同時保證嘌呤不被酸破壞，就能保證方法準確性。在 90 ℃水浴下，分別考察10、20、30、40、50 min下牛肉樣品的水解效果見圖5。從圖5中可以看出，90 ℃水解30 min后嘌呤含量基本不變，核酸物質接近水解完全，因此最終選取水解時間為30 min。

圖5   不同水解時間下嘌呤含量測定結果

Fig. 5   Detection results of purine under different hydrolysis times

2.3 線性范圍和檢出限

在1.3儀器工作條件下，對系列混合標準工作溶液進行測定，使用外標法進行定量，以4種嘌呤的質量濃度（x）為橫坐標，對應的色譜峰面積（y）為縱坐標，進行線性擬合，繪制標準工作曲線。分別以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)計算各目標物的檢出限和定量限。4種嘌呤的線性范圍、線性方程、線性相關系數、檢出限及定量限見表1。由表1可知，各化合物的質量濃度在0.1～20 μg/mL范圍內與色譜峰面積具有良好的線性關系，線性相關系數均在 0.999以上，檢出限為0.007~0.014 μg/mL，定量限為0.023~0.045 μg/mL，表明該方法靈敏度良好，適于定量。

表1   線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限

Tab. 1   Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit, and quantification limit

2.4 精密度試驗

混合均勻的牛肉樣品均分為7份，分別按1.4.1方法處理，在1.3儀器工作條件下，測定各目標物的色譜峰面積，并計算對應的嘌呤含量，試驗結果見表2。由表2可知，鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤測定結果的相對標準偏差分別為1.09%、0.877%、0.332%、1.71%，表明該方法精密度良好、重現性高，可應用于樣品檢測。

表2   牛肉中嘌呤精密度試驗結果

Tab. 2   Precision test results of purine in beef

2.5 樣品加標回收試驗

采用所建方法對牛肉樣品進行低、中、高3個濃度水平的加標回收試驗，平行測定3次，試驗結果見表3。由表3可知，加標樣品中4種嘌呤的加標回收率為97.8%～100.6%，表明該方法準確度良好，可應用于食品中嘌呤的檢測。

表3   牛肉中嘌呤加標回收試驗結果

Tab. 3   Results of purine spiked recovery test in beef

2.6 樣品測定

采用所建方法對水產等10類共41種食品進行測定，每種食品取樣3次，檢測結果取平均值，測定結果見表4。由表4可知，嘌呤含量（質量分數，同下）大于1.50 mg/g（高嘌呤）的食品包括水產類、內臟類、畜禽肉類、豆類、干制品類、濃湯寶和部分調味品；嘌呤含量為0.50～1.50 mg/g（中嘌呤）的食品包括部分調味品和部分蔬菜類；嘌呤含量小于0.50 mg/g（低嘌呤）的食品包括部分蔬菜類、菌類、酒類。常見食物中總嘌呤的含量由高到低排列，依次為水產類、內臟類、畜禽類、豆類、干制品、濃湯寶、調味品、蔬菜類、菌類、酒類。

表4   不同食品中嘌呤含量

Tab. 4   Purine content in different foods ( mg/g )

3 結論

采用高效液相色譜法測定食品中鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤4種嘌呤的含量。從食物樣品處理、色譜分離條件等方面進行優化，建立了食品中4種嘌呤的最佳檢測方法，并驗證了方法的線性范圍、精密度、準確度，所建方法具有快捷、高效、準確、精密度好等優點，可為檢測技術的發展和應用提供堅實的科學依據和技術支持。采用該方法測定了10類共41種不同食品中4種嘌呤的含量，驗證了該方法在實際應用中的有效性和可行性。結果發現食品中嘌呤含量差異較大，日常應合理膳食，避免長期大量攝入高嘌呤食物，減少患高尿酸血癥和痛風的可能性。

參考文獻

1 李婷婷，任麗琨，王當豐，等.高效液相色譜法測定海水魚中嘌呤含量 ［J］.中國食品學報，2020，20（5）： 266.
    LI Tingting， REN Likun， WANG Dangfeng，et al. Determination of purines content of sea fish by high performance liquid chromatograp ［J］. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology， 2020， 20（5）： 266.

2 KANEKO K， TAKAYANAGI F， FUKUUCHI T， et al. Determination of total purine and purine base content of 80 food products to aid nutritional therapy for gout and hyperuricemia ［J］. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids， 2020， 39（10-12）： 1 449.

3 SO M W， LIM D H ， KIM S H ， et al. Dietary and nutritional factors associated with hyperuricemia： The seventh Korean National Health and Nutrition Examination Survey ［J］. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition， 2020， 29（3）： 609.

4 HUANG C， ZHENG M， HUANG Y Z， et al. The effect of purine content on sensory quality of pork ［J］. Meat Science， 2021， 172： 108.

5 房志鵬， 于冰， 叢海林，等.凝膠滲透色譜柱填料研究現狀 ［J］.分析測試學報，2021， 40（6）： 836.
    FANG Zhipeng， YU Bing， CONG Hailin， et al. Research status of fillers for gel permeation chromatography columns ［J］. Journal of Analysis and Testing， 2021， 40（6）： 836.

6 方妍， 謝定源， 丁璐，等. 優化高效液相色譜法測定雞肉及雞湯中嘌呤含量 ［J］.中國調味品，2020， 5（12）： 115.
    FANG Yan， XIE Dingyuan， DING Lu， et al. Optimization of high performance liquid chromatography for detecting purine content in chicken and chicken soup ［J］. China Condiment， 2020， 45（12）： 115.

7 VURAN B， ULUSOY H I， SARP G， et al. Determination of chloramphenicol and tetracycline residues in milk samples by means of nanofiber coated magnetic particles prior to high-performance liquid chromatography-diode array detection ［J］. Talanta， 2021， 230： 122307.

8 孫玉鳳， 黃亞濤， 劉佳萌，等. 超高效液相色譜法檢測58種大豆中的4種嘌呤化合物 ［J］.中國食品學報，2023，23（6）： 304.
    SUN Yufeng， HUNG Yatao， LIU Jiameng， et al. Determination of 4 purine compounds in 58 soybean by ultra-high performance liquid chromatography［J］. Chinese Journal of Food Science， 2023， 23（6）： 304.

9 鄭麗婷，王瑞恒，樂虹雯，等. 高效液相色譜法測定啤酒中嘌呤含量 ［J］. 現代食品，2021（15）： 205.
    ZHENG Liting， WANG Ruiheng， LE Hongwen， et al. Determination of purine in beer by high performance liquid chromatography ［J］. Modern Food， 2021（15）： 205.

10 柳靜， 趙榕， 范賽，等. 超高效液相色譜法測定中式菜肴中4種嘌呤 ［J］. 衛生研究，2023， 52（2）： 313.
    LIU Jing， ZHAO Rong， FAN Sai， et al. Determination of 4 purines in Chinese cuisine by ultra-high performance liquid chromatography ［J］. Health Research， 2023， 52（2）： 313.

11 JIA Q， YANG Z， WANG Q， et al. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for comprehensive deter-mination of metabolites in the purine pathway of rat plasma and its application in anti-gout effects of Lycium ruthenicum Murr ［J］. Journal of Separation Science， 2023， 46（21）： e2 300 090.

12 彭松林， 曾治國， 張濤，等. 肉類嘌呤含量及降嘌呤方法研究進展 ［J］. 食品與發酵工業，2022， 48（18）： 314.
    PENG Songlin， ZENG Zhiguo， ZHANGTao， et al. Research progress of purine content in meat and methods of reducing Purine［J］. Food and Fermentation Industry， 2022， 48（18）： 314.

13 FENG X， MA H， ZOU L， et al. Determination of purines in prepackaged food using optimum acid hydrolysis followed by high performance liquid chromatography ［J］. Food Chemistry， 2023， 417： 135 813.

14 YUAN J， YANG C， CAO J， et al. Effects of low temperature-ultrasound-papain （LTUP） combined treatments on purine removal from pork loin and its influence on meat quality and nutritional value ［J］. Foods， 2024， 13（8）： 1 215.

15 李萍. 啤酒中嘌呤類物質的檢測 ［J］.中國食品工業，2022（8）： 89.
    LI Ping. Detection of purines in beer ［J］. China Food Industry， 2022（8）： 89.