在進行清潔驗證時，我們通常需要確定一系列限度，這些限度包括對活性蛋白或其他主要物質成分的分析、清潔劑的分析、生物負載水平的分析、內毒素水平的分析，以及對設備進行目視檢查以確保其清潔。如果存在任何與活性蛋白或其他工藝組分相關的特殊毒性物質，如細胞毒性、變應原性或生殖危害物，生產商的毒理學或生理學團隊必須評估是否需要調整這些限度，或者是否需要使用專用設備以確保安全。

在討論這些限度時，我們應考慮自然殘留物以及生產過程的不同階段，比如原液生產與配制/分裝階段。原液生產階段包括所有旨在獲取活性藥物的步驟，而配制/分裝階段則涉及將原液加入到成品制劑中，并進行藥品物質的初級包裝。原液生產過程可以進一步細分為上游生產步驟，即在藥物收獲前的所有步驟，以及下游生產步驟，包括藥物的純化和后續步驟。這些階段的考慮對于確保清潔驗證的限度既科學又實用至關重要。

1，活性物限度的關鍵問題

在生物技術領域，清潔過程可能會導致活性分子，尤其是蛋白質，發生結構改變和降解。以下是蛋白質降解的主要機制：

①在堿性溶液中，尤其是在高溫條件下，含有氫氧化鈉或氫氧化鉀的溶液會使蛋白質水解成可溶的寡聚物或自由氨基酸。

② 酯基團的水解，例如皂化反應，將脂肪和油脂轉化為甘油和脂肪酸。

③ 次氯酸鈉作為一種清潔劑，能有效去除變性蛋白質殘留。它是一種強氧化劑，能使蛋白質降解成更小的片段。使用時需注意其對不銹鋼的潛在危害，并確保漂洗循環能徹底清除氯離子殘留。

④ 在高pH值環境下，蛋白質水解受時間和溫度的顯著影響，pH值和溫度越高，水解越容易發生。

蛋白質降解后的小片段更易溶于水，更容易通過清潔和漂洗過程從設備表面去除。此外，高pH值環境下的蛋白質水解可能導致其生物活性不可逆地顯著下降。

在實驗室中，可以通過將活性物質暴露在模擬清潔條件下的清潔溶液中，然后對生成的混合物進行分析和生物化學測試來驗證活性物的降解。

由于活性物質的降解，生物技術制造商在清潔驗證流程中通常不直接設置活性限度或檢測活性。清潔過程完成后，理論上不應有活性物質殘留。因此，通常使用總有機碳（TOC）等非特異性分析方法來檢測蛋白質殘留或片段。需要注意的是，清潔后的真正蛋白質殘留非常低，因為TOC檢測的是所有有機碳源，而不僅僅是活性蛋白的殘余。

在制劑和最終分裝中，蛋白質活性限度的設定通常基于污染量計算（MAC或最大可允許的傳遞量），與小分子清潔驗證使用同樣的方法。如果清潔方法導致活性蛋白降解為小分子片段，該方法代表了最差情況。對于長期使用的產品，一個典型的方法是允許隨后制造的最大活性日治療劑量的產品中攜帶不超過最小活性日治療劑量的1/1000。此外，如果計算允許在隨后的藥物產品中活性蛋白殘留量超過10ppm，可以使用10 ppm活性藥物蛋白的限度。單位面積的限度可以基于下一個最小批量的藥物生產所共用的設備面積上計算出來。

在原液生產中，制劑/分裝的污染量計算通常不適用，因為如果污染量計算基于整個生產線的設備表面積，限度會非常低，除非藥物活性成分在清潔過程中不會降解，否則無法用現行分析技術測量。活性物的殘留通常通過TOC等間接測量方法來檢測。通常清潔驗證TOC的定量限度大約為100-500 ppb碳，與含碳量為50%的約200-1000 ppb蛋白質的數值等效。

另一種建立活性物限度的方法是基于毒理學計算，這涉及到活性物質短期的毒理學數據，最終得出允許的日攝入量（ADI）。如果數據是基于口服的毒理學，對注射藥的清潔應增加安全系數。這種基于安全考慮的計算通常會導致較高的限度。如果活性蛋白降解，相關的毒理學數據更可能是降解碎片的毒理學，而不是天然蛋白質的毒理學，通常認為后者安全問題更少。

2，清潔劑的限度

在生物制藥生產中，清潔劑的限度取決于不同的生產階段，如制劑/分裝和原液生產。一個典型的清潔程序可能包括使用強堿性清潔劑，隨后是磷酸鹽清潔劑，或者先是堿性清潔劑后是酸性清潔劑，這些步驟都是分開進行的。

① 市售化學試劑的限度：如果清潔過程中僅使用了市售化學試劑，如氫氧化鈉和磷酸，通常會基于電導率值來設定間接的限度。更精確的方法是，基于毒理學污染量計算或工藝參數效果來確定氫氧化鈉或磷酸的可接受水平，并將電導率限度設定在特定溫度下的相應濃度。這個限度通常比相同溫度下的注射用水的電導率限度要嚴格，例如設定為5 μS/cm。這是因為這個限度比科學計算的限定值更嚴格。此外，由于磷離子或鈉離子可能是后續產品的成分，少量的污染并不明顯。需要注意的是，市售化學試劑的毒性計算是基于極端情況，因為這些化學物質不會以其原始形式污染最終產品。如果這些化學物質高濃度污染，工藝檢查（如pH的顯著變化）會發現這種不符合性。因此，目標是確認清潔劑含量非常低，而不是要求與注射用水的標準一致。允許電導率限度略高于注射用水的原因是，一旦水從循環管路中取出并通過清潔設備，就不應期望它一定滿足WFI的電導率限度。

②處方清潔劑的限度：對于制劑/分裝制造，處方清潔劑（可能包含無機氫氧化物和多種有機組分）殘留量的限度通常基于其短期毒性（LD50）數據來計算污染量。這種毒性資料可以由清潔劑制造商提供，或基于處方成分分析的最壞情況假設來計算。如果處方清潔劑的默認值比污染量計算的值更嚴格，也可以采用。處方清潔劑的默認值一般為10ppm。活性物污染量計算與處方清潔劑污染量計算的不同之處在于，它們對后續產品的污染限度計算方法不同，一個使用的是劑量比率，而另一個用的是半致死率LD50比率。一旦完成計算，隨后的清潔劑限度計算使用與活性物同樣的公式，來確定每個拭子或每個分析樣品的限度。

對于原液生產，適用于活性物限度的一些問題也同樣適用于清潔劑。也就是說，考慮到整個共享面積的污染量計算值通常非常低，難以測量。但是，使用的處方洗滌劑通常在分離提純過程中可以根據分子量去除（例如通過超濾或分子排阻色譜法）。與活性成分的限度一樣，毒性計算可能適用于下游純化后的步驟或下游工藝的最后一個容器。

3，微生物限度

在考慮清潔后微生物限度時，重要的是要認識到清潔過程本身并不會使設備達到無菌狀態。即便設備將在位滅菌或在下一產品生產前進行滅菌，通常的做法是評估微生物負載，以確保后續的生產工藝不會受到過度的微生物挑戰。一般來說，達到非無菌生產環境下的微生物限度標準（即每平方厘米表面取樣1-2CFU）就已經足夠。

對于沖洗取樣，不同公司可能會采用不同的微生物限度標準。一些公司可能會采用典型的注射用水標準（WFI值，即每100毫升水中10 CFU），而其他公司可能會采用每100毫升水中100 CFU或1,000 CFU的標準。設定較高限度的原因是設備隨后將進行滅菌處理，因此允許有更高的微生物限度。

此外，需要注意的是，WFI值是在管路中循環的注射用水的標準。一旦這些水從循環管路中取出并加入到設備中，就不應期望其微生物限度必然符合原有的注射用水標準。這是因為在轉移過程中，水可能會從空氣中吸收微生物，導致微生物含量增加。因此，在設定微生物限度時，需要考慮到這些因素，以確保生產環境的安全性和產品的質量問題。

4，內毒素限度

內毒素的污染問題在產品最終階段尤為關鍵，因此對最終產品的內毒素污染量需要特別關注。在這一過程中，內毒素的測定通常在最終的沖洗水中進行，其限度一般設定為符合注射用水的標準，即0.25EU/ml。

在細胞培養過程中，內毒素去除步驟之前的沖洗水取樣應達到注射用水的限度。然而，對于使用大腸桿菌這類革蘭氏陰性細菌進行的細菌發酵過程，由于這些細菌在沖洗過程中可能產生大量內毒素，因此在發酵和收獲步驟之后的清洗中達到注射用水限度是不現實的。在這種情況下，一些公司會設定一個更高的內毒素限度，如5至25 EU/mL。

達到這一更高的限度水平表明清潔工藝是受控的，而且任何在這一水平上的潛在污染都應在隨后的內毒素清除步驟中進行評估。這樣的做法確保了即使在難以完全清除內毒素的發酵過程中，最終產品的質量也能得到保障。

5，視覺清潔標準

外觀目測是驗證殘留物去除效果的一種直接方法。雖然它不是一種定量手段，但對于檢查產品表面的清潔狀況非常有用。只要能夠接觸到關鍵表面，外觀目測就很容易執行，它可以確認生產設備重要區域的清潔程度。根據文獻，少量的殘留物如果存在，通常是可見并可被察覺的。在生物制藥領域，目測清潔標準通常作為清潔驗證方案的一部分，用于測試擦拭和/或沖洗液中的殘留物。這種方法有助于確保生產設備在關鍵區域的清潔度達到預期標準。

6，修改限度

作為日常工藝驗證監測的一部分，應設立行動限度和警戒限度。這些限度通常比驗證方案中設定的合格/失敗限度更為嚴格。通過觀察工藝能力的連續低水平表現以及維持這些水平的能力，可以進行風險評估。基于這樣的評估，可以考慮在未來的驗證方案中采用更嚴格的限度標準。這種做法有助于確保工藝的持續穩定性和產品質量的高標準。