摘 要： 以枸杞為原料，通過水提醇沉方式得到枸杞粗多糖，建立柱前衍生-氣相色譜法測定枸杞粗多糖中4種糖醛酸（D-葡萄糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-甘露糖醛酸、D-半乳糖醛酸）的含量。采用三氟乙酸作為水解劑，于120 ℃水解90 min，采用HP-1701毛細(xì)管色譜柱分離，分流比為15∶1，氫火焰離子化檢測器（FID）檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，4種糖醛酸的質(zhì)量濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。樣品加標(biāo)回收率為90.55%～96.40%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%（n=6）。該方法滿足枸杞粗多糖中糖醛酸含量的檢測。

關(guān)鍵詞： 氣相色譜； 枸杞； 粗多糖； 糖醛酸

 

 

枸杞，為茄科枸杞屬多年生木本植物，是一種藥食同源的營養(yǎng)保健蔬菜和名貴中藥。枸杞多糖是一種水溶性多糖，是枸杞中最主要的活性成分，是國內(nèi)外研究者們關(guān)注的熱點。現(xiàn)已有大量研究表明，枸杞多糖具有促進(jìn)免疫、抗衰老、抗腫瘤、清除自由基、抗疲勞、抗輻射、保肝以及改善生殖功能等作用[1?6]。

糖醛酸是指糖中的伯羥基被氧化成羧基后形成的化合物及其衍生物，此類化合物易于形成內(nèi)酯，糖醛酸通常以吡喃糖和呋喃糖形式與相應(yīng)的內(nèi)酯處于平衡狀態(tài)。天然存在的糖醛酸以與糖苷配基結(jié)合的糖醛酸苷形式或聚糖醛酸的形式存在，是樹膠質(zhì)、果膠、半纖維素、藻酸、細(xì)菌多糖等細(xì)胞壁或黏液物質(zhì)的主要成分。糖醛酸在人體內(nèi)具有多種生理功能，如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗氧化性、保護(hù)細(xì)胞免受損害等[7?11]，因此測定糖醛酸含量對于評估食物的營養(yǎng)價值和生物活性至關(guān)重要。

目前，對于多糖中單糖的含量測定報道較多[12?15]，但針對多糖中糖醛酸含量的測定方法鮮見。筆者采用柱前衍生技術(shù)，建立氣相色譜(GC)測定枸杞粗多糖中D-葡萄糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-甘露糖醛酸、D-半乳糖醛酸4種糖醛酸的分析方法，該方法靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為評估枸杞的營養(yǎng)價值和生物活性，促進(jìn)枸杞在多領(lǐng)域的開放利用與科學(xué)研究提供一定的技術(shù)支持。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：7890B型，配FID檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

純水/超純水一體化系統(tǒng)：Milli-Q Direct-Q8型，美國密理博公司。

電子分析天平：BSA224S型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。

三氟乙酸：分析純，上海安譜實驗科技股份有限公司。

甲醇：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司。

乙酸、正丙胺、吡啶、乙酸酐：均為分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

三氯甲烷：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司。

D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）為99.9%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW(E) 76955，壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

L-艾杜糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于98.0%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW(E) ZG-31380，上海安譜實驗科技有限公司。

D-甘露糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.0%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW(E) 2298895，四川省維克奇生物科技有限公司。

D-半乳糖糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.7%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW(E) 77375，壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

枸杞樣品：市售。

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：HP-1701型毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：15∶1；FID溫度：280 ℃；升溫程序：初始爐溫為50 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升溫至180 ℃，以5 ℃/min升溫至260 ℃，保持10 min。

1.3 溶液配制

糖醛酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確稱取4種糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg于10 mL容量瓶中，加水定容至標(biāo)線，得4種糖醛酸質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

糖醛酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至標(biāo)線，得質(zhì)量濃度分別為0、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 μg/m的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 實驗方法

1.4.1 糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液衍生化反應(yīng)

分別準(zhǔn)確移取0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL 4種糖醛酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，均加水至2 mL，加入10 mg硼氫化鈉，于室溫放置約1 h，滴加1 mL乙酸除去多余的硼氫化鈉，于80 ℃減壓蒸干，期間分2～3次加入約5 mL甲醇，蒸干去除硼酸鹽，于烘箱中90 ℃下加熱2 h，將糖醛酸轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)酯，將殘渣溶于1 mL吡啶中，加入1 mL正丙胺，密封，于55 ℃加熱30 min，冷卻，氮氣吹干，殘渣依次加入1 mL吡啶和1 mL乙酸酐，密封，于90 ℃加熱30 min，冷卻，加入1.0 mL三氯甲烷溶解，水洗2～3次，吸取下層溶液作為糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)衍生物溶液。

1.4.2 枸杞粗多糖的提取

稱取500 g干枸杞，搗碎，使用95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的乙醇溶液回流除去脂肪，殘渣于90 ℃烘箱烘干后稱其質(zhì)量，用20倍量的水在80 ℃的條件下提取2 h，過濾，重復(fù)提取1次，合并濾液，濃縮至一定體積，離心，取上清液，在不斷攪拌下加入95%乙醇溶液使得溶液中乙醇溶液的最終體積分?jǐn)?shù)為70%，靜置10 h，離心，收集沉淀，冷凍干燥，得到枸杞粗多糖。

1.4.3 樣品衍生化反應(yīng)

準(zhǔn)確稱取枸杞粗多糖100 mg于水解管中，加入5 mL 2 mol/L 三氟乙酸，充氮氣1 min，將水解管密封，于120 ℃水解90 min，減壓濃縮至干，再分2～3次加入甲醇蒸干去除多余三氟乙酸，以后操作過程同1.4.1。

1.4.4 樣品測定

移取適量衍生樣品溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，注入氣相色譜儀測定，依據(jù)色譜峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

 

2、 結(jié)果與討論

 

2.1 水解劑的選擇

多糖的水解一般采用的方式為酸水解，常見可供選擇的酸包括乙酸、鹽酸、硫酸、三氟乙酸、磷酸等。采用相同濃度(2 mol/L)的乙酸、鹽酸、硫酸、三氟乙酸、磷酸5種酸水解劑分別對枸杞粗多糖進(jìn)行水解，4種糖醛酸衍生物色譜峰面積變化情況如圖1所示。從圖1可以看出，采用三氟乙酸作為水解劑水解后4種糖醛酸衍生物峰面積均高于其他4種酸，水解效率最高，因此選擇三氟乙酸作為水解劑。

圖1   5種酸水解枸杞粗多糖中4種糖醛酸衍生物色譜峰面積

Fig. 1   Chromatographic peak area of four uronic acid derivatives in five kinds of acid hydrolyzed Lycium barbarum crude polysaccharides

2.2 水解溫度的選擇

稱取枸杞粗多糖100 mg，經(jīng)1.4.3處理，其他條件不變，考察水解溫度分別為90、100、110、120、130、140、150 ℃下對4種糖醛酸衍生物色譜峰面積的影響，如圖2所示。從圖2可以看出，水解溫度為90～120 ℃時，隨著水解溫度升高，4種糖醛酸衍生物的峰面積均有所增加，當(dāng)水解溫度達(dá)到120 ℃時，4種糖醛酸衍生物的峰面積均基本趨于穩(wěn)定，同時考慮到水解溫度過高可能會導(dǎo)致目標(biāo)物結(jié)構(gòu)破壞，影響檢測結(jié)果，因此采用120 ℃作為水解溫度。

圖2   不同水解溫度下枸杞粗多糖水解后4種糖醛酸衍生物的色譜峰面積

Fig. 2   Effect of hydrolysis temperature on the peak area of four uronic acid derivatives of Lycium barbarum crude polysaccharides after hydrolysis

2.3 水解時間的選擇

稱取枸杞粗多糖100 mg，經(jīng)1.4.3處理，考察水解溫度分別為30、60、90、120、150 min下對4種糖醛酸衍生物色譜峰面積的影響，如圖3所示。從圖3可以看出，水解時間小于60 min時，隨著平衡時間延長，4種糖醛酸衍生物的色譜峰面積均有所增加，當(dāng)水解時間為90 min時達(dá)到動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)平衡時間繼續(xù)延長，4種糖醛酸衍生物峰面積均無明顯增加。同時，水解時間過長可能會導(dǎo)致雜質(zhì)峰的增加，因此選擇水解時間為90 min。

圖3   不同水解時間對應(yīng)的枸杞粗多糖水解后4種糖醛酸衍生物色譜峰面積

Fig. 3   Effect of hydrolysis time on the peak area of four uronic acid derivatives of Lycium barbarum crude polysaccharides after hydrolysis

2.4 色譜柱的選擇

考察HP-5柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、HP-1701柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)、CD-624柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)、HP-INNOWAX柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)4種常見色譜柱的分離效果，結(jié)果表明，HP-1701色譜柱的分離效果最佳，HP-INNOWA的分離效果最差，HP-5柱與CD-624柱分離對于D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖醛酸兩種糖醛酸色譜峰分離效果較差，同時柱箱升溫程序?qū)?種糖醛酸分離度也存在一定影響。經(jīng)過多次試驗發(fā)現(xiàn)，采用HP-1701色譜柱，4種糖醛酸分離效果佳，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖4所示。

 

  1—D-葡萄糖醛酸衍生物；2—D-甘露糖醛酸衍生物；3—L-艾杜糖醛酸衍生物；4—D-半乳糖醛酸衍生物圖4　4種糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液色譜圖

Fig. 4   GC spectrum of standard mixed solution of uronic acid

2.5 分流比的選擇

理論上來說，分流比越低，靈敏度就越高，但D-葡萄糖醛酸與D-甘露糖醛酸，L-艾杜糖醛酸與D-半乳糖醛酸在氣相色譜圖中出峰位置接近，容易相互干擾，從而影響到分離效果，可能造成定量的不準(zhǔn)確。通過實驗摸索，最終選擇15∶1的分流比，一方面減少兩者進(jìn)入到色譜柱產(chǎn)生的干擾，另一方面保證了檢測的靈敏度。

2.6 線性關(guān)系、檢出限與定量限

取糖醛酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)樣測定，分別以4種糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，其色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限。4種糖醛酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限見表1，由表1可知，4種糖醛酸的質(zhì)量濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。

表1   4種糖醛酸質(zhì)量濃度的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

Tab. 1   Linear relationship，detection limit and quantification limit

 

2.7 加標(biāo)回收及精密度試驗

稱取枸杞粗多糖試樣100 mg，分別加入質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20、100、1 000 μL，按照1.4.3步驟處理后測定，每組樣品平行測定6次，測定結(jié)果見表2。加標(biāo)前樣品與加標(biāo)后樣品色譜圖如圖5所示，由表2可知，4種糖醛酸相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.38%～6.19%(n=6)。4種糖醛酸平均回收率為90.55%～96.40%，該方法精密度、準(zhǔn)確度滿足分析要求。

表2   加標(biāo)回收及精密度試驗結(jié)果

Tab. 2   Precision and standard addition recovery test results

圖5   枸杞粗多糖及加標(biāo)枸杞粗多糖樣品的氣相色譜圖

 

Fig. 5   GC spectrumof Lycium barbarum crude polysaccharide and spiked Lycium barbarum crude polysaccharide samples

 

1—D-葡萄糖醛酸衍生物；2—D-甘露糖醛酸衍生物；3—L-艾杜糖醛酸衍生物；4—D-半乳糖醛酸衍生物

 

3、 結(jié)語

 

以枸杞粗多糖為檢測對象，通過對水解及色譜條件的選擇和優(yōu)化，建立柱前衍生-氣相色譜法測定枸杞粗多糖中糖醛酸的含量。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重現(xiàn)性佳，可為枸杞樣品中多糖的結(jié)構(gòu)組成及其活性研究提供技術(shù)支持與數(shù)據(jù)參考。

 

 

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