受損的皮膚無法阻止有害細(xì)菌侵入組織，導(dǎo)致傷口感染，甚至嚴(yán)重的組織損傷。聚合物水凝膠可以保持良好的親水性并具有可調(diào)節(jié)的物理和生物相容性，被認(rèn)為是最有前途的傷口敷料。本期，EFL以發(fā)表在雜志《Bioactive Materials》的“Construction of multifunctional hydrogel with metal-polyphenol capsules for infected full-thickness skin wound healing”研究為例，解析如何利用甲基丙烯酸透明質(zhì)酸（HAMA）與甲基丙烯酸改性絲素蛋白（SilMA）交聯(lián)的抗菌復(fù)合水凝膠促進傷口血管生成并抑制炎癥。
理想的傷口敷料需要提供堅固的屏障，防止外部感染，并引導(dǎo)皮膚細(xì)胞整合和浸潤以促進傷口愈合。足夠的機械強度和保濕能力、良好的生物相容性和易于細(xì)胞黏附都是傷口敷料所必需的。在這些不同的敷料中，聚合物水凝膠可以保持良好的親水性并具有可調(diào)節(jié)的物理和生物相容性，被認(rèn)為是最有前途的傷口敷料候選。在聚合物水凝膠中，透明質(zhì)酸（HA）是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種天然聚合物，具有良好的生物相容性；絲素蛋白（Sil）是從蠶絲中分離出來的纖維部分，由于其機械性能和優(yōu)異的生物相容性，已被探索用于傷口愈合；本研究利用甲基丙烯酸透明質(zhì)酸（HAMA）與甲基丙烯酸改性絲素蛋白（SilMA）交聯(lián)形成雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠，構(gòu)建一種金屬多酚膠囊（Cu-EGCG），并加載到SilMA/HAMA水凝膠傷口敷料中，以實現(xiàn)EGCG和銅離子的持續(xù)釋放，以制備具有良好生物相容性和力學(xué)性能的復(fù)合水凝膠，更好地滿足應(yīng)用于傷口敷料的要求。
2. 如何制備HAMA/SilMA/Cu-EGCG 水凝膠
（1）Cu-EGCG 的合成：將EGCG、CuCl2水溶液和MOPS 緩沖液添加到樣品中渦旋。通過洗滌除去過量的EGCG和CuCl2 ，得到Cu-EGCG；
（2）SilMA/HAMA 的制備：首先配制濃度為10%的SilMA水溶液，以及1%-2%（w/v）的HAMA溶液，以1:1的體積比混合在SilMA溶液中。將濃度為0.1%的LAP添加到混合溶液中作為光引發(fā)劑，用藍光（405 nm）照射溶液 10 秒以誘導(dǎo)光交聯(lián)。
（3）HAMA/SilMA/Cu-EGCG的合成：通過一步離子/分子組裝過程，將Cu-EGCG加載到SilMA/HAMA水凝膠傷口敷料中，圖1。
圖1 HAMA/SilMA/Cu-EGCG的合成和應(yīng)用示意圖
3. HAMA/SilMA/Cu-EGCG的優(yōu)勢和作用
（1）HAMA/SilMA/Cu-EGCG具有良好的物理、機械和抗菌性能
SilMA/HAMA水凝膠的溶脹比隨著HAMA濃度的增加而降低。所有水凝膠均在3 h時達到溶脹平衡狀態(tài)，并在隨后的時間內(nèi)保持穩(wěn)定的溶脹速率，表明水凝膠具有較好的尺寸穩(wěn)定性，有利于水凝膠敷料吸收傷口滲出液。此外，水凝膠可以穩(wěn)定地呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)，SilMA水凝膠的抗壓強度為70.1 kPa，最大壓縮性能為151 kPa，具有良好的交聯(lián)度和機械性能。這些結(jié)果表明，SilMA/HAMA水凝膠的抗壓強度可以通過改變HAMA的濃度來調(diào)節(jié)，而抗壓強度的可調(diào)性意味著它可以更好地應(yīng)用于各種組織和器官，使其成為一種具有良好應(yīng)用前景的生物材料。降解曲線顯示，SilMA/HAMA水凝膠組的降解速率比純SilMA水凝膠組相對慢，說明這兩組水凝膠的交聯(lián)程度相對較高。負(fù)載Cu-EGCG水凝膠的的釋放曲線顯示， Cu2+的釋放在96 h后趨于平緩，表明在水凝膠和金屬多酚膠囊的雙重作用下，Cu2+的釋放有效延長。最后，SilMA/HAMA/Cu-EGCG水凝膠具有較好的抗菌效果，其中SilMA/HAMA/Cu-EGCG (200) 水凝膠的抗菌效果最好，瓊脂平板上的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌含量最少。
圖2 水凝膠的物理性能、機械性能和抗菌性能
（2）HAMA/SilMA/Cu-EGCG促進細(xì)胞增殖、遷移和血管形成
水凝膠與L929細(xì)胞共培養(yǎng)3天后，細(xì)胞存活率達到100%以上，表明水凝膠無毒性，有利于細(xì)胞增殖。L929細(xì)胞培養(yǎng)3天后，幾乎所有水凝膠都發(fā)出綠色熒光，并且很少有細(xì)胞死亡。此外，SilMA/HAMA/Cu-EGCG組遷移細(xì)胞數(shù)顯著高于其他組，遷移率在32小時內(nèi)達到80%或更高。在血管形成實驗中， SilMA/HAMA/Cu-EGCG組有明顯的小管形成和分支點（圖3）。說明SilMA/HAMA/Cu-EGCG水凝膠具有良好的生物相容性，促進細(xì)胞增殖、遷移和血管形成，具有作為水凝膠敷料的潛力。
圖3 水凝膠的體外生物相容性、遷移和血管化評估
（3）HAMA/SilMA/Cu-EGCG促進傷口愈合
SilMA/HAMA/Cu-EGCG水凝膠組傷口愈合較好，明顯高于空白對照組。第7天，五組傷口全部開始結(jié)痂，傷口收縮明顯，其中水凝膠組愈合最好。上述結(jié)果表明，水凝膠中Cu2+和EGCG的協(xié)同作用可以促進感染傷口的愈合。為了進一步研究水凝膠對傷口愈合的影響，通過蘇木精伊紅(H&E)和Masson染色觀察傷口愈合過程，SilMA/HAMA/Cu-EGCG組第7天的肉芽組織厚度較其他組要大，第14天觀察到毛細(xì)血管的生長和皮膚附屬器的恢復(fù)，Masson染色顯示SilMA/HAMA/Cu-EGCG組創(chuàng)面膠原沉積面積較大，膠原纖維較致密。以上結(jié)果表明SilMA/HAMA/Cu-EGCG組的傷口顯示出更快的愈合效果（圖4）。
圖4 水凝膠的體內(nèi)感染傷口愈合研究
（4）SilMA/HAMA/Cu-EGCG在體內(nèi)促進血管形成和抗炎
在SilMA/HAMA/Cu-EGCG組覆蓋的傷口中觀察到更多的新生血管。免疫熒光染色定量分析顯示，第7天SilMA/HAMA/Cu-EGCG組CD31和α-SMA的表達水平顯著高于其他組。表明，SilMA/HAMA/Cu-EGCG水凝膠具有良好的促進血管生成的能力，更有利于促進血管網(wǎng)絡(luò)的三維組裝和重建，可為上皮細(xì)胞的再生提供營養(yǎng)，加速血管生成，促進傷口愈合。在體內(nèi)抗炎實驗中，SilMA/HAMA/Cu-EGCG組中的iNOS（M1標(biāo)記）表達下降，CD68（M2標(biāo)記）表達升高，抗炎因子TGF-β1和IL-4的表達上調(diào)，促炎因子TNF-α和IFN-γ的表達下調(diào)，表明巨噬細(xì)胞可有效地從M1到M2極化，發(fā)揮抗炎作用，改變傷口炎癥微環(huán)境，促進基質(zhì)再生和血管重塑（圖5-6）。
圖5 傷口愈合的免疫熒光染色研究
圖6 炎癥水平的免疫熒光染色研究
4. 總結(jié)
綜上所述，本研究采用光固化方法成功制備了SilMA/HAMA水凝膠，并負(fù)載金屬多酚膠囊（Cu-EGCG），實現(xiàn)了銅離子的持續(xù)釋放。該水凝膠具有良好的機械性能和生物相容性。含有Cu-EGCG的水凝膠可以顯著促進L929成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。體外和體內(nèi)抗菌活性表明，含Cu-EGCG的水凝膠具有優(yōu)異的抗菌活性，有效減少大鼠感染傷口中的細(xì)菌數(shù)量。動物實驗結(jié)果表明，SilMA/HAMA/Cu-EGCG水凝膠可以促進大鼠感染傷口愈合，增加膠原蛋白沉積，促進血管生成，減少細(xì)菌數(shù)量，平衡炎癥浸潤。
文獻來源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.12.009
