藥物的溶出度試驗(yàn)是膠囊劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一，目前進(jìn)行體外溶出試驗(yàn)是各國(guó)藥典中檢驗(yàn)?zāi)z囊劑溶出度的一種手段。明膠膠囊在膠囊劑中應(yīng)用最多。但是由于明膠膠囊原材料、填充物和貯存條件等因素，會(huì)出現(xiàn)明膠交聯(lián)現(xiàn)象。此類明膠膠囊在進(jìn)行體外溶出試驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)崩解和溶出遲緩的現(xiàn)象，不能反映膠囊劑的實(shí)際溶出度，導(dǎo)致不能正確地控制明膠膠囊劑的質(zhì)量。本文對(duì)明膠膠囊的交聯(lián)現(xiàn)象及體外溶出試驗(yàn)中該問題的解決方案和研究進(jìn)行綜述。
1.明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象
1.1.明膠
明膠是一種水溶性蛋白質(zhì)混合物，由皮膚、韌帶、肌腱中的膠原經(jīng)酸或堿部分水解或在水中煮沸制得。按生產(chǎn)方式分類，可分為酸法明膠(A型明膠)、堿法明膠(B型明膠)和酶法明膠。其中B型明膠產(chǎn)量最高。3種明膠可以單獨(dú)使用，也可以混合使用，得到的明膠性質(zhì)有所不同，如B型明膠穩(wěn)定性比A型明膠強(qiáng)，而A型明膠可塑性強(qiáng)，透明度高。使用明膠制備的膠囊，凍力強(qiáng)度越高， 在水中崩解所用時(shí)間越長(zhǎng)。
明膠含有18種氨基酸，主要的氨基酸含量為：甘氨酸25.5%、脯氨酸18.0%、羥脯氨酸14.1%、谷氨酸11.4%、丙氨酸8.5%、精氨酸8.5%、賴氨酸4.1%、亮氨酸3.2%、纈氨酸2.5%。
1.2.明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象
明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象指明膠囊殼在貯存過程中發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使制劑在不加酶的溶出介質(zhì)中的崩解、溶出、釋放效率降低的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)生交聯(lián)現(xiàn)象的膠囊在人體內(nèi)未發(fā)生部分不溶現(xiàn)象，但是在進(jìn)行體外溶出試驗(yàn)時(shí)，膠囊發(fā)生交聯(lián)部分表現(xiàn)為橡膠質(zhì)脹大的水不溶膜，從而阻止藥物的釋放。其主要原因是由于明膠自身發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，即明膠中賴氨酸、精氨酸的側(cè)鏈氨基被氧化，生成醛基，并與其他氨基發(fā)生胺縮醛反應(yīng)。Duconseille等對(duì)明膠膠囊的交聯(lián)反應(yīng)原理進(jìn)行了綜述，但仍有部分交聯(lián)方式的原理未確定。其中賴氨酸的交聯(lián)率最高，其生成的交聯(lián)鍵也最穩(wěn)定。此外，天然提取明膠中存在的微量醛和藥物以及藥用輔料中的含醛物也會(huì)與賴氨酸、精氨酸的氨基發(fā)生胺縮醛反應(yīng)，形成交聯(lián)明膠。
使用常規(guī)溶出條件對(duì)明膠交聯(lián)膠囊進(jìn)行體外溶出試驗(yàn)，并繪制溶出曲線，溶出曲線表明交聯(lián)膠囊會(huì)出現(xiàn)溶出延遲現(xiàn)象。這種現(xiàn)象導(dǎo)致的溶出延遲一般出現(xiàn)在溶出試驗(yàn)初始時(shí)間段。由于人體胃液的環(huán)境與體外溶出環(huán)境不同，胃液中含有酶，此溶出延遲現(xiàn)象對(duì)于體內(nèi)溶出并沒有參考意義。
2.影響明膠膠囊囊殼交聯(lián)的因素
2.1.囊內(nèi)交聯(lián)
2.1.1.囊殼處方因素
囊殼處方是決定囊殼交聯(lián)的主要因素：(1)明膠的選擇：明膠的交聯(lián)程度主要是受明膠中氨基酸的殘基量影響，明膠中賴氨酸和精氨酸的含量越低，則交聯(lián)發(fā)生程度和可能性越低。(2)囊殼的含水量：囊殼中含水量高時(shí)，可以加快明膠的氧化，使亞胺中間體的產(chǎn)生加快。(3)增塑劑：甘油和山梨醇等增塑劑會(huì)使明膠的自氧化作用增強(qiáng)。(4)遮光劑和著色劑：加入的遮光劑和著色劑可能誘導(dǎo)醛類分子產(chǎn)生，從而與明膠發(fā)生胺縮醛反應(yīng)。(5)鐵離子：膠囊中含有鐵離子，使氨基酸經(jīng)芬頓化學(xué)反應(yīng)，生成羥基自由基(OH)，羥基自由基氧化氨基酸的氨基和中心碳原子，導(dǎo)致明膠交聯(lián)，但鐵離子含量對(duì)交聯(lián)現(xiàn)象的影響不能確定。(6)鐵離子和鋁離子：Fe3+除催化羥基自由基生成外，F(xiàn)e3+和Al3+能與明膠游離的羥基形成配合物。
2.1.2.充填物處方因素
充填物處方是明膠囊內(nèi)交聯(lián)的主要因素：(1)藥物：含有醛基的藥物與明膠殘基發(fā)生反應(yīng)，使明膠發(fā)生交聯(lián)。(2)藥用輔料：加入的輔料中含有防腐劑、脂肪類物質(zhì)或聚氧乙烯類化合物等，均有可能促使明膠發(fā)生交聯(lián)。
2.1.3.貯存條件
膠囊應(yīng)貯存在溫度15~25℃，相對(duì)濕度30%~40%，陰涼干燥避光處貯存。當(dāng)溫度升高時(shí)，膠囊的交聯(lián)程度明顯提高，而在溫度不變時(shí)，相對(duì)濕度變化對(duì)膠囊交聯(lián)程度的影響較小。
2.2.囊外交聯(lián)
由于膠囊外部因素引起的膠囊交聯(lián)現(xiàn)象屬于囊外交聯(lián)。膠囊貯存環(huán)境中含有微量醛類，使膠囊外部與醛類發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。Colgan等針對(duì)囊外交聯(lián)現(xiàn)象，在膠囊包裝中添加活性炭，吸附包裝中的少量甲醛，減少膠囊交聯(lián)現(xiàn)象。與未添加活性炭的包裝明膠膠囊對(duì)比，在高溫潮濕地區(qū)環(huán)境中，該包裝中明膠膠囊更穩(wěn)定。
3.體外溶出試驗(yàn)中明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象的解決方案及研究
3.1.添加蛋白酶
目前體外溶出試驗(yàn)均使用脫氣去離子水，根據(jù)樣品的不同調(diào)整pH，添加適量的表面活性劑，從而促進(jìn)藥物的溶出。但是此方法不足以模擬胃液的環(huán)境。Meyer等認(rèn)為現(xiàn)有的溶出方式存在極大的缺陷，需要在溶出介質(zhì)中添加蛋白酶，從而能夠更真實(shí)地模擬胃液的環(huán)境。蛋白酶能夠切斷明膠分子中交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的酰胺鍵，因此可以加速高度交聯(lián)的明膠水解，從而消除明膠膠囊交聯(lián)導(dǎo)致的體外溶出延遲現(xiàn)象。由于膠囊交聯(lián)現(xiàn)象的影響，USP對(duì)溶出度測(cè)定項(xiàng)進(jìn)行了修訂，部分試驗(yàn)的溶出介質(zhì)中加入蛋白酶，進(jìn)行二級(jí)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。但是其他藥典均未在溶出度項(xiàng)加入添加酶試驗(yàn)項(xiàng)，若膠囊劑樣品出現(xiàn)囊殼交聯(lián)現(xiàn)象，易被判定為不合格。
Clair等根據(jù)USP<711>中的二級(jí)溶出試驗(yàn)系統(tǒng)，即添加酶和不添加酶系統(tǒng)部分，對(duì)交聯(lián)后的膠囊和未交聯(lián)膠囊進(jìn)行了溶出度試驗(yàn)。結(jié)果表明，即便是交聯(lián)程度很高的硬膠囊，在添加酶的溶出介質(zhì)中進(jìn)行試驗(yàn)，得到的溶出曲線與未交聯(lián)膠囊在未加酶的溶出介質(zhì)中的溶出曲線有高度一致性。但其并未對(duì)溶出介質(zhì)中添加酶的最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)。
USP溶出度<711>中提出使用的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶。胃蛋白酶在pH為2時(shí)活性最高，當(dāng)pH<1.5或>4.5時(shí)，活性明顯降低。木瓜蛋白酶選擇的最佳pH為6.0~7.0，但是底物為明膠時(shí)最佳pH為5.0，當(dāng)pH<2.8時(shí)，活性明顯下降。菠蘿蛋白酶一般在pH為5.0~7.0時(shí)使用，在pH為3.0~6.5時(shí)，菠蘿蛋白酶與底物結(jié)合后，其活性將不受到pH影響。胰蛋白酶在pH為 6.0~8.0時(shí)具有良好的活性，但在酸性和強(qiáng)堿性環(huán)境將迅速失活。USP溶出度<711>修訂建議對(duì)于溶出度試驗(yàn)的溶出介質(zhì)添加酶的條件給出了建議。胃蛋白酶建議pH≤4.0，木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶建議4.0≤pH≤6.8，胰蛋白酶建議pH≥6.8。
添加酶雖然能夠解決明膠膠囊的交聯(lián)問題，但是目前部分品種藥物的溶出試驗(yàn)中，為增加藥物的溶解度加入了表面活性劑，而酶對(duì)環(huán)境條件較為敏感，溶出介質(zhì)不同，酶的活性也不同。在建立添加蛋白酶的溶出方法時(shí)，需要確保溶出環(huán)境適合藥物溶出，同時(shí)要確保蛋白酶有足夠的活性以切除交聯(lián)明膠產(chǎn)生的肽鍵，使交聯(lián)膠囊的溶出與未交聯(lián)膠囊的溶出行為一致。
Guzman等就胃蛋白酶分別在含十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和吐溫-80 4 種表面活性劑的溶出介質(zhì)中的活性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，添加SDS會(huì)降低胃蛋白酶的活性，即使低濃度SDS仍會(huì)明顯降低其活性。而添加任意濃度的CTAB、Triton X-100 和吐溫-80 均不會(huì)影響胃蛋白酶的活性。Guncheva等對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行相似研究，結(jié)果為非離子型表面活性劑(吐溫-80和Triton X-100)能夠增強(qiáng)胰蛋白酶的活性，而離子型表面活性劑(SDS和CTAB)會(huì)抑制其活性，因此在添加胰蛋白酶的體外溶出試驗(yàn)中建議使用非離子型表面活性劑。關(guān)于表面活性劑對(duì)溶出介質(zhì)中木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶活性的影響研究尚未見報(bào)道。
目前對(duì)于出現(xiàn)明膠交聯(lián)現(xiàn)象的膠囊劑，即溶出試驗(yàn)中不能正常崩解，膠囊表現(xiàn)為橡膠質(zhì)脹大的水不溶膜，可參照USP溶出度<711>添加酶，解決體外溶出試驗(yàn)中交聯(lián)膠囊溶出延遲問題，正確控制膠囊劑的質(zhì)量。
3.2.模擬胃部機(jī)械運(yùn)動(dòng)
USP溶出度方法中包括幾種生理學(xué)因素，如溶解介質(zhì)的pH和組成，表面活性劑和酶。但是目前各國(guó)藥典的溶出方法仍不能體現(xiàn)動(dòng)態(tài)和復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境。除了添加酶外，胃部的動(dòng)態(tài)環(huán)境也可能對(duì)交聯(lián)明膠的崩解產(chǎn)生一定影響。
Gao開發(fā)了一種新的溶出裝置，能更加真實(shí)地模擬體內(nèi)環(huán)境，結(jié)構(gòu)見圖1。由于胃部會(huì)進(jìn)行收縮，該溶出裝置通過下方樣品托盤伸縮來(lái)模擬胃部收縮，上方使用探針施加恒定的力(約 0.01 g)，來(lái)探測(cè)膠囊的膨脹或收縮變化，并且可以防止膠囊浮動(dòng)。底部添加磁力攪拌器，使溶出介質(zhì)流動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過調(diào)整伸縮力的大小和方式，可與USP溶出度二法結(jié)果達(dá)到基本一致，并同時(shí)監(jiān)測(cè)膠囊表面的收縮變化。實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)交聯(lián)軟膠囊施加較為復(fù)雜的力變化，并未促使膠囊溶出加快，且膠囊未直接崩解，藥物逐步釋放，溶出時(shí)間也較慢。
該研究表明復(fù)雜的胃部收縮運(yùn)動(dòng)對(duì)于交聯(lián)軟膠囊的崩解影響有限，仍需要添加適量蛋白酶，從而解決膠囊崩解延遲的問題。但為解決人體溶出條件和現(xiàn)有溶出條件相差較大的問題，新溶出方法的設(shè)計(jì)需要生理學(xué)相關(guān)的條件，以便體外試驗(yàn)可以更接近人體內(nèi)的實(shí)際狀態(tài)，此新裝置為新溶出方法的的建立提供了一定的基礎(chǔ)。
4.小結(jié)與展望
明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象廣泛存在于各類明膠膠囊劑中，使現(xiàn)有溶出裝置不能正確反映交聯(lián)膠囊的溶出度。USP針對(duì)此現(xiàn)象最先提出了解決指導(dǎo)意見。目前已有較多針對(duì)添加酶對(duì)溶出結(jié)果的研究，并且建立了部分藥物的新溶出方法，使交聯(lián)膠囊溶出度結(jié)果與未交聯(lián)膠囊保持一致，為新溶出方法修訂提供了理論支撐。各國(guó)藥典在修訂時(shí)，建議參考USP<711>以及現(xiàn)有關(guān)于交聯(lián)明膠膠囊的研究，制定更為符合實(shí)際溶出條件的新方法。但是目前的溶出條件仍然與體內(nèi)溶出條件相差較大，開發(fā)更加接近體內(nèi)溶出環(huán)境的新方法，對(duì)藥物產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量評(píng)價(jià)和生物相關(guān)性評(píng)價(jià)有重要作用。
