他達拉非（Tadalafil）是一種選擇性、可逆性的磷酸二酯酶 5（PDE5）抑制劑，用于治療男性勃起功能障礙（ED），該藥具有諸多優點如選擇性高、不良反應小、半衰期較長等[1~2]。他達拉非片原研品為美國禮來公司生產的 Cialis。他達拉非的生物藥劑學分類（BCS）為Ⅱ類[3~4]，即低溶解性-高滲透性藥物，原料粒徑對產品溶出和體內生物等效具有關鍵影響。目前國內有針對他達拉非片的制備和體內外評價進行研究[5~6]，上述主要研究了處方組成、溶出曲線和 Beagle 犬體內藥動學特征，抑或僅對人體生物等效性試驗開展研究[7~8]，未見對處方工藝、溶出曲線和人體生物等效性的綜合研究。因此本研究以 Cialis（規格：20 mg）為參比制劑，對自制品處方工藝進行篩選，并考察二者溶出曲線相似性，最終通過人體內生物等效性研究確定自制品的處方工藝。
1、儀器與材料
1.1 儀器
GF-300A2X 型高效萬能粉碎機（上海天祥·健臺）；J-50 型氣流粉碎機（意大利馬西姆公司）；LHS300 型濕法混合制粒機（浙江迦南科技）；ZL450 型門式整粒機（浙江迦南科技）；FZG-5 低溫真空烘箱（南京飛龍制藥）；HZD-1000 型自動提升料斗混合機（浙江迦南科技）；S250-SMART型 32 沖壓片機（山東新馬制藥）；BG-150E 型高效智能包衣機（浙江江南制藥）；DPR-320G 熱帶型泡罩包裝機（瑞安市江華機械）；YD-Ⅱ型片劑硬度測試儀（天津光學儀器）；Mastersizer-3000型馬爾文粒度儀（英國 Malvern 公司）；RC12A 型溶出度儀（天津天大天發）；LC-20A 型、LC30AD型高效液相色譜儀（日本 Shimadzu 公司）；Quad 6500 型三重四極桿質譜儀（加拿大 Sciex 公司）。
1.2 材料
他達拉非片（Lilly USA，商品名 Cialis，規格 20 mg，批號 C949202），他達拉非（珠海聯邦制藥），一水乳糖 200M（DMV-Fonterra）；微晶纖維素（山東聊城阿華）；交聯羧甲纖維素鈉（德國瑞登梅爾）；十二烷基硫酸鈉（葛店人福）；羥丙纖維素-L（日本曹達，取代度 65%）；硬脂酸鎂（山東聊城）；薄膜包衣預混劑（上海卡樂康）；異丙醇、乙腈、正己烷均為色譜純；其他試劑均為分析純。
2、方法與結果
2.1他達拉非片的制備
參考俄羅斯藥監局公布的禮來公司產品 Cialis（規格：20 mg）藥品說明書[9]，選擇與 Cialis 相同的輔料種類和用量進行樣品制備。稱取粉碎后原料 70.00 g、交聯羧甲纖維素鈉 44.10 g、十二烷基硫酸鈉 3.43 g 和一水乳糖 858.18 g，混合均勻，另取羥丙纖維素 28.18 g 溶于純化水中配制成黏合劑溶液，加入至上述完成預混的物料中，濕法制粒，干燥，整粒，再將微晶纖維素 183.75 g、交聯羧甲纖維素鈉 34.30 kg 和硬脂酸鎂 3.08 g 加入干顆粒中，混合 10 min，壓片，包衣，即得自制品。
2.2溶出曲線方法
2.2.1溶出條件
參考他達拉非片進口藥品注冊標準[10]，溶出方法選擇槳法；轉速 50 r·min-1；溶出介質為 0.5%十二烷基硫酸鈉溶液，體積 1 000 mL，溫度 37.0 ℃。
2.2.2色譜條件
色譜柱填充劑為辛烷基硅烷鍵合硅膠（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相為 0.1%三氟乙酸溶液:乙腈=55:45（V/V）；檢測波長為 285 nm；流速為 1.2 mL·min-1；柱溫 40 ℃；進樣體積 50 μL。
2.2.3 對照品溶液
精密稱定他達拉非對照品約 20 mg，置 100 mL 量瓶中，用乙腈 20 mL 超聲溶解，用溶出介質稀釋成 0.20 g·L-1 的貯備液，搖勻，精密量取 5 mL 置 50 mL 量瓶中，用溶出介質稀釋成 20 mg·L-1 的對照品溶液，搖勻。
2.2.4 供試品溶液
取他達拉非片 6 片，按溶出條件進行操作，在各取樣點時間分別取溶液 10 mL，濾過，取續濾液作為供試品溶液，并及時補充溶出介質 10 mL。
2.2.5 方法學驗證
本色譜條件下他達拉非進樣量（X）在 0.105～2.090 μg 范圍內與峰面積（Y）線性關系良好，回歸方程為 Y=1.689×106X+798，r=1.000 0。取 10、30 min 溶出液配制供試品溶液，分別測定室溫放置 0、1、2、3、4、6、8、10、12 h 后樣品的峰面積，測定結果 RSD 值分別為 0.10%、0.10%，表明該方法穩定性良好。選擇四個濃度（100%、80%、40%、20%）考察回收率（n=3），均值為 100.3%，RSD 值為 0.50%，表明該方法準確度和精密度良好。
2.3 處方工藝考察
他達拉非片為普通薄膜包衣片劑，其活性成分他達拉非的生物藥劑學分類（BCS）為Ⅱ類（低溶解性、高滲透性）[3~4]，結合歐盟 EMEA 關于他達拉非片科學性論述內容[11]，在制備片劑前需對原料進行微粉化處理，再采用濕法制粒工藝進行樣品制備。試驗初期選擇高效萬能粉碎（100 目篩）對原料進行前處理。為保證自制品與參比制劑的質量一致性，自制品的輔料種類和用量主要參考俄羅斯公布的 Cialis 藥品說明書（20 mg），選擇一水乳糖（70.05%）和微晶纖維素（15.0%）為填充劑、交聯羧甲纖維素鈉（6.4%）為崩解劑、羥丙纖維素（2.3%）為黏合劑、十二烷基硫酸鈉（0.28%）為助流劑和硬脂酸鎂（0.25%）為潤滑劑。本研究在此基礎上，以溶出曲線相似性為評價指標，對處方工藝中的黏合劑濃度、片芯硬度、濕法制粒時間和原料前處理方式分別進行考察。
2.3.1黏合劑濃度考察
取羥丙纖維素3 份（每份 28.18 g），分別溶于 3 份純化水（441.49 g、324.07g、253.62 g），配制 6%、8%和 10% 3 個濃度的溶液，參照“2.1”項下方法，將上述 3 份溶液全部用于制備片劑，再按照“2.2”項下方法進行溶出曲線考察，結果見圖 1。
在濕法制粒過程中發現，黏合劑濃度為 6%時，水量最多，所制顆粒有部分呈條狀；濃度 10%時，水量最少，所制顆粒較少、細粉較多；濃度 8%時，水量居中，制得顆粒外觀較為理想，顆粒較多，物料流動性和可壓性均良好。3 個濃度（6%、8%、10%）所制片劑與 Cialis 的溶出曲線相似因子 f2 值分別是 61、76、74，均符合溶出相似的要求。綜合考慮，選擇黏合劑濃度為 8%。
2.3.2片芯硬度考察
片芯的硬度對片芯的脆碎度、包衣的磨損情況、產品的崩解和溶出行為具有直接影響，為了確定硬度對本品的影響，篩選合理的硬度范圍，故對硬度進行了考察，分別按照4～6 kg、6～9 kg 和 9～11 kg 3 個硬度范圍進行樣品制備，對不同硬度對應的壓片情況、脆碎度、包衣情況和溶出曲線進行考察，結果見圖 2。
由考察結果可知，硬度 4～6 kg 時，片芯脆碎度相對較高，包衣情況磨損較大，不符合制備要求；硬度 6～9 kg 和 9～11 kg 均符合制備要求，且兩硬度范圍自制品與 Cialis 的溶出曲線相似因子f2 值分別是 80 和 64，選擇與 Cialis 溶出相似度更高的 6～9 kg 作為自制品的硬度控制范圍。
2.3.3 濕法制粒時間考察
濕法制粒的攪拌制粒時間主要影響所制顆粒的松緊程度，最終影響產品的溶出行為。針對濕法制粒操作，設置濕法混合制粒機參數（攪拌槳Ⅰ速與制粒槳Ⅰ速），分別考察制粒 2、3、4 min 樣品的溶出曲線，結果見圖 3。
如圖 3 所示，隨著濕法制粒時間的延長，產品的溶出速率有逐漸降低的趨勢。當制粒時間為 2 min時，所制樣品與 Cialis 的相似因子 f2值為 59，當制粒時間為 3～4 min 時，所制樣品與 Cialis 的溶出行為則具有更好的相似性（f2=80、75），因此選擇 3～4 min 作為自制品的濕法制粒時間。
2.3.4 原料前處理考察
由于他達拉非的生物藥劑學分類為Ⅱ類，不僅需要對原料進行微粉化處理，而且需要在溶出介質中添加增溶劑 SDS。為了確認原料粒度的影響，分別采用高效萬能粉碎和氣流粉碎的方式對原料進行處理。完成樣品制備后，為提高溶出曲線區分力，將溶出介質中的增溶劑 SDS 濃度由 0.5%降低至 0.3%進行溶出曲線對比。兩種粉碎方式的原料粒度分布結果見表 1，溶出結果見圖 4。
由考察結果可知，氣流粉碎原料比高效萬能粉碎原料粒徑更細，且在 0.3%SDS 溶出介質中，采用高效萬能粉碎原料制備的自制品與 Cialis 的相似因子 f2值為 63，而采用氣流粉碎原料制備的自制品與 Cialis 的相似性更高（f2=76），因此選擇氣流粉碎作為原料的前處理方式。
2.4 處方工藝確認
根據處方工藝考察結果，選擇氣流粉碎原料進行中試樣品制備（批量：10 萬片）：稱取氣流粉碎后原料 2.011 kg（含他達拉非 2.000 kg）、交聯羧甲纖維素鈉 1.26 kg、十二烷基硫酸鈉 0.098 kg和一水乳糖 24.52 kg，混合均勻，另取羥丙纖維素 0.805 kg 溶于 9.26 kg 純化水中（濃度 8%），加入至上述完成預混的物料中，濕法制粒 3～4 min，干燥至水分≤4.0%后，整粒，再將微晶纖維素 5.25kg、交聯羧甲纖維素鈉 0.98 kg 和硬脂酸鎂 0.088 kg 加入干顆粒中，混合 10 min，壓片（片芯硬度控制 6～9 kg），包衣（理論增重 4%），即得自制品。
分別測定自制品和參比制劑在 0.5%SDS 溶液（A）、0.3%SDS 溶液（B）、含 0.5% SDS 的 0.01mol·L-1 的鹽酸溶液（C）、含 0.3% SDS 的 pH 4.5 醋酸鈉緩沖液（D）、含 0.3% SDS 的 pH 6.8 磷酸鹽緩沖液（E）5 種溶出介質中的溶出曲線，見圖 5。
由考察結果可知，自制品與 Cialis 在上述 A～E 5 個溶出介質中的相似因子 f2 值分別為 58、75、65、70、62，均符合相似要求。
2.5生物等效性研究
為進一步確認自制品與 Cialis 體內藥效一致性，選擇采用“2.4”項下處方工藝確認批自制品與Cialis 進行空腹條件下給藥的人體生物等效性研究。
2.5.1 受試者選擇
本研究經東莞康華醫院倫理委員會批準。所有受試者均簽署了知情同意書。本研究入組10名健康成人男性受試者，年齡為18~45歲，身體質量指數（BMI）在19 kg·m-2至26 kg·m-2之間。
2.5.2 給藥方法
采用單劑量、兩序列、兩周期、自身交叉的試驗方案，受試者統一禁食過夜，次日清晨空腹口服 1 片自制品或 Cialis，服藥后禁食 4 h，4、10 h 以后統一進餐。
2.5.3 血樣采集和處理
分別于給藥 0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、5.00、6.00、9.00、12.00、24.00、48.00、72.00、96.00 h 采集靜脈血（每管 4 mL）至已標記好含有 K2EDTA的真空采血管中，輕柔顛倒 6 次混勻，離心 10 min，抽取上層血漿置于 2 個 2 mL 凍存管中，1 h 內轉移至-20℃或以下冰箱中暫存，24 h 內轉移至-80℃冰箱中儲存。
2.5.4 測定方法和樣品處理
2.5.4.1 色譜條件
色譜柱 XBridge C18（3.5 μm，4.6mm×50 mm），流動相 A 為含 5 mmol·L-1 甲酸銨和 0.1%甲酸的水溶液，流動相 B 為乙腈：水（90:10，V/V）的混合溶液，梯度洗脫（0.01 min 50%B，1.70 min 50% B，1.80 min 100% B，2.60 min 100% B，2.70 min 50% B）。流速：300 μL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 μL。
2.5.4.2 質譜條件
電噴霧離子源（ESI）；正離子多反應監測模式（MRM）；用于定量分析的離子對為他達拉非 m/z 390.2→268.1，他達拉非-d3（內標）m/z 393.2→271.0，碰撞能量（CE）17 eV；去簇電壓（DP）130 V。源參數：噴射電壓（IS）3 000 V，離子化溫度（Temp）500 ℃，碰撞氣（CAD）5 psi，氣簾氣（CUR）30 psi，噴霧氣（Gas1）60 psi，輔助氣（Gas2）60 psi。
2.5.4.3 血漿樣品處理
在 96 孔板中加入血漿樣品 100 μL，內標溶液（他達拉非-d3）50 μL，乙腈300 μL，渦流混勻 10min，離心 10 min（8℃，4 000 r·min-1）。取上清液 200 μL 至另一潔凈 96 孔板中，用 300 μL 流動相 B 復溶，取上清液 20 μL 進行 LC-MS/MS 分析。
2.5.5 檢測結果
采用 LC-MS/MS 法測定不同時間點血漿中他達拉非的藥物濃度，平均血藥濃度-時間曲線見圖 6。采用 Phoenix WinNonlin 7.0 軟件以非房室模型法（NCA）對血藥濃度數據進行擬合處理，自制品和 Cialis 的平均藥動學參數描述性統計結果見表 2。
由上述結果可知，自制品與 Cialis 的達峰時間（Tmax）、達峰濃度（Cmax），AUC0-t 和 AUC0-∞均相近。采用 SAS 9.4 軟件進行統計分析，采用平均生物等效性評價的方法對自制品和 Cialis 的藥代動力學參數進行評價，自制品與 Cialis 的 Cmax、AUC0-t 和 AUC0-∞的 90%置信區間分別為 84.35%～98.00%、86.32%～106.43%和 85.91%～106.89%，均落在可接受范圍內（80%~125%），可知自制品與 Cialis 具有生物等效性。
3、討論
本研究以 Cialis 處方為基礎、以體外溶出行為作為評價指標對自制品進行處方工藝篩選。當溶出介質中增溶劑 SDS 濃度為 0.5%時，增溶效果可能會掩蓋不同粒徑原料所制備的樣品的溶出差異。根據 SDS 臨界膠束濃度（8.2 mmol·L-1，換算成質量體積分數為 0.236%）[12]，在保證增溶效果的前提下，將 SDS 濃度降低至 0.3%，可提高溶出曲線的區分力，有助于篩選出更合理的原料前處理方式。
按照確定的處方工藝進行中試樣品制備，所制樣品與 Cialis 的體外溶出行為相似，且人體生物等效性研究顯示自制品與 Cialis 的 Cmax、AUC0-t 和 AUC0-∞的 90%置信區間均落在可接受范圍內（80%~125%），證明自制品與 Cialis 在體內可達到生物等效。
他達拉非片生物等效性研究的樣本量需根據試驗結果的幾何均數比（GMR）和個體內變異系數（CV）等計算。本試驗中 CV 最大值為 13.19%，可知他達拉非屬于非高變異藥物，結合查表法可知，檢驗效能為 80%時估算樣本量為 12 例（未考慮脫落 20%的情況），因此在以后他達拉非片生物等效性研究中，可適當將樣本量增加至 12 例以上。
本研究過程中所采用的原料前處理方式、處方工藝、經過調整的溶出方法和生物等效性研究方法，可為他達拉非片的樣品研制、體外溶出和體內生物等效性研究提供相應指導。
