了解固定相常見的鍵合方式及其修飾，有助于掌握各類型色譜柱的使用條件，提高方法開發效率。

制備反相色譜柱填料常用的方法是在有機硅烷和硅醇的硅膠顆粒表面上發生共價反應，來“鍵合”生成固定相或者配合基R：

X3-Si-R+≡Si-OH→≡Si-O-Si（X2）-R+HX

（硅烷）（硅烷醇）（最后的固定相）

HPLC柱子的制備可通過幾種不同的硅烷-硅膠反應來實現。單體相是反相柱子里使用最廣泛的技術，即一個硅烷分子和硅醇基反應。這種一對一鍵合，使生成的鍵合相相對完善并且具有很好的重現性。這樣制作的填料通常會具有最高的柱效，因為固定相層相對不擁擠，因此溶質分子能夠快速擴散進出固定相。相反，多官能團的、高度聚合的固定相則表現出較低的溶質擴散速度和較低的柱效，尤其是在流動相流速較高的情況下。

最初反相色譜填料的存在的主要問題為較窄的pH耐受性和對堿性物質的吸附，由此而造成峰形不對稱、保留值不穩定等。針對這些問題，生產廠商采用了一系列技術來達到穩定性高、重現性好、分離效率高的目的。

1  多鍵鍵合

目前單體的硅烷-硅膠鍵合技術主要分為四種：單鍵鍵合（Agilent ZORBAX Eclipse系列）、雙鍵鍵合（Waters SunFire）、三鍵鍵合（Waters XSelect系列）、雙齒鍵合（Agilent ZORBAX Extend系列）。單鍵鍵合有利于提高傳質速率，加快色譜柱平衡。但當pH＜2時，會產生鍵合相的水解，固定相的流失，溶質分子的保留能力下降。使用多鍵鍵合的方式（雙鍵鍵合、三鍵鍵合和雙齒鍵合）可以提高固定相在低pH條件下的穩定性。

備注：其中Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18其硅烷側鏈連接了甲基進行保護，因此其耐受pH較Waters SunFire略高。

2  硅膠封端

為了減小不想要的硅烷醇基與溶質的相互作用，反相色譜柱的填料通常需要封端。硅膠封端即將C18反應到硅膠表面上之后，再利用硅烷化方法把小分子的氯硅烷和尚未完全反應的硅羥基進行反應，使之成為不能和堿性化合物作用的硅醚。在制備烷基化硅膠時只有約50%的硅羥基可以反應，剩余的硅羥基可以用封端的方法進行反應，常見的封端試劑是三甲基氯硅烷（TMCS）。較小的配合基（比如，封端的三甲基硅烷）在pH較低時更容易被水解和破壞，這會造成保留時間和選擇性的改變。另一方面來說，封端后的色譜柱提高了填料在堿性條件下的穩定性，降低填料流失，同時還能促使色譜柱對極性和堿性化合物的分離且提供良好的峰形。

3  空間位阻保護——側鏈烷基

在鍵合到硅膠表面的十八烷基上引入甲基，異丙基或異丁基，較大的笨重的異丁基側鏈干擾了鍵合相的水解?？臻g保護對于低pH的分離實驗非常有幫助，避免了低pH條件下O-Si鍵的斷裂，但不能用在高pH條件下。具有空間保護功能的固定相可以以多種配合基的形式存在（比如，C8、C18、氰基、苯基），每個配合基在流動相較低的pH條件下均能保持較高的穩定性（pH低至0.8）。其中典型代表為Agilent ZORBAX StableBond系列色譜柱和月旭Ultimate LP系列色譜柱。

4  嵌入極性基團

一般反相色譜柱對強極性和強堿性物質分離較差，在反相固定相的碳鏈中嵌入極性基團（如脲基、酰胺基、醚基或甲酸酯基），提高對此類物質的選擇性，同時極性基團屏蔽了硅膠表面的硅醇基作用，可極大改善峰形，在測定堿性物質時不拖尾。典型代表如采用酰胺基團Waters XBridge BEH Shield RP色譜柱，采用甲酸酯基團的Agilent Zorbax Bonus RP色譜柱；采用脲基ES Industries Chromegabond ODS-P1色譜柱以及采用醚基的Agilent Polaris C18色譜柱等。

另外碳鏈中存在極性基團，使固定相的親水性濕潤性增強，在使用95%以上的高含水流動相時，不會發生相塌陷。與普通的反相C18和C8柱有不同的選擇性，特別是對于酚類等極性物質。解決相塌陷還有另外兩種常見方式，①極性封尾，極性的封尾基團能使水浸潤并滲透到硅烷表面，保持烷基的伸展，提高極性化合物的保留能力。②降低碳載量，使填料微孔內被流動相填滿，提高極性化合物的保留能力。

5  帶電填料顆粒

在常規的色譜柱填料表面施予電荷，如Waters CSH系列色譜柱。通過帶電修飾，可以在一根色譜柱上實現兩種或多種分離機理，如疏水作用和靜電作用，即反相和離子交換作用。此外，表面的微量正電荷在低離子強度的分離體系中與被電離的堿性化合物相互排斥，抑制了堿性化合物和殘留硅羥基的離子交換作用，從而獲得良好的峰形。

參考文獻

現代液相色譜技術導論（第3版）

高效液相色譜進展（四）—反相HPLC固定相和色譜柱近年的發展