高效液相色譜中梯度方法觀察到的鬼峰有許多可能的原因，然而幾乎總有一個(gè)共同的機(jī)制即：當(dāng)流動(dòng)相具有較高的洗脫強(qiáng)度時(shí)，流動(dòng)相中有紫外吸收的有機(jī)雜質(zhì)在柱上聚焦成組分帶，并隨后在梯度中洗脫。這些流動(dòng)相雜質(zhì)的潛在“來源”是廣泛的。鬼峰的其他原因包括流動(dòng)相輸送的物理或機(jī)械方面、樣品引入和固定相效應(yīng)。色譜圖可能包含來自各種來源的鬼峰，這使得鬼峰問題的整體解決非常困難。

 

      在下面的討論中，更詳細(xì)地說明了雜質(zhì)聚焦機(jī)理，并討論了一些新的和以前公認(rèn)的原因以及識(shí)別和修復(fù)鬼峰問題的技巧。

 

一、流動(dòng)相污染與能帶壓縮機(jī)制

 

     在所有色譜中，縱向擴(kuò)散會(huì)增加分離組分的帶寬。在等度色譜高效液相色譜中，人們?cè)噲D在縱向擴(kuò)散變得不可控制和峰太寬之前洗脫組分。在梯度洗脫色譜中，存在動(dòng)態(tài)壓縮組分帶的主動(dòng)聚焦機(jī)制(帶/峰壓縮)。梯度高效液相色譜運(yùn)行中觀察到的峰寬是同步擴(kuò)散和聚焦過程的產(chǎn)物。在線性溶劑梯度中，峰寬在整個(gè)過程中應(yīng)該近似恒定。

 

       聚焦機(jī)制可以合理化如下：想象一個(gè)組分帶廣泛擴(kuò)散在高效液相色譜柱的頂部。當(dāng)施加溶劑梯度時(shí)，帶后部的有機(jī)溶劑濃度總是高于帶前部。因此，帶前的組分分子比帶后的組分分子更強(qiáng)地被固定相保留。因此，帶后的成分分子總是更快移動(dòng)，任何落后的會(huì)被更強(qiáng)的洗脫液聚集，并更快地向前移動(dòng)以趕上其余的。假設(shè)柱足夠長并且梯度足夠陡，峰值聚焦(或壓縮)逐漸發(fā)展的擴(kuò)散和聚焦過程的平衡決定最終峰值寬度的程度，如下圖所示。縱向擴(kuò)散通過使用較小直徑的球形顆粒而最小化，例如3μm而不是5μm的二氧化硅。通過增加梯度陡度，頻帶壓縮機(jī)制被最大化。

 

圖1 組分帶通過提高洗脫強(qiáng)度的溶劑梯度被壓縮的示意圖

 

      帶聚焦機(jī)制可以類似地聚焦流動(dòng)相中存在的有機(jī)雜質(zhì)。在低洗脫劑濃度下表現(xiàn)出一定保留的雜質(zhì)可能會(huì)隨著梯度的進(jìn)行而聚集成峰。同樣的“痕量富集”機(jī)制被用于環(huán)境分析，其中農(nóng)藥和有機(jī)殘留物從大量含水樣品中裝載到柱上，然后用聚焦溶劑梯度洗脫。在充分聚焦后，流動(dòng)相鬼峰似乎與注入的分析物峰相同，然而，當(dāng)聚焦不完全時(shí)，它們可能更寬或具有非典型形狀。

 

      圖2為加入鄰苯二甲酸二辛酯的流動(dòng)相色譜圖，顯示了如何通過聚焦機(jī)制，在空白梯度運(yùn)行中可以觀察到流動(dòng)相中約1納克/毫升水平的雜質(zhì)。盡管鄰苯二甲酸二辛酯鬼峰很小，但它仍可能干擾藥物分析中低水平有機(jī)雜質(zhì)的定量。

 

      理想的梯度HPLC流動(dòng)相到達(dá)頂部該柱應(yīng)僅包含預(yù)期的溶劑和試劑，絕對(duì)不包含其他任何物質(zhì)。梯度高效液相色譜不是只分析樣品，也分析流動(dòng)相的雜質(zhì)和儀器路徑的溶劑。為了區(qū)分真實(shí)的分析物峰和這些系統(tǒng)(或鬼)峰，空白進(jìn)樣的檢查是必不可少的。

 

 

圖2 為加入鄰苯二甲酸二辛酯的流動(dòng)相色譜圖

 

1、水

 

      用于梯度高效液相色譜的水必須盡可能純凈和新鮮。理想情況下，它應(yīng)該不含微量有機(jī)物、無機(jī)物和微粒。幸運(yùn)的是，對(duì)于忙碌的藥物分析員來說，商業(yè)上可獲得的設(shè)備可以滿足實(shí)驗(yàn)室的需要，因此水不應(yīng)該是一個(gè)問題，然而，為了獲得好的結(jié)果，這些凈化器系統(tǒng)必須被設(shè)置和保持在高標(biāo)準(zhǔn)。Milli-Q和Elga Maxima是能夠提供這種質(zhì)量的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)的主要部件首先是重活性炭和5 μm預(yù)濾器(去除顆粒并將氯含量降低到亞克/毫升水平)、反滲透裝置(去除大部分離子種類)和紫外線光氧化以殺死細(xì)菌和氧化有機(jī)種類。使用離子交換和碳吸附介質(zhì)進(jìn)一步降低無機(jī)和有機(jī)含量，并使用超微濾單元(0.05um)，最終去除細(xì)菌和細(xì)顆粒。系統(tǒng)應(yīng)定期消毒和更換耗材。間歇循環(huán)還應(yīng)定期重新凈化系統(tǒng)中的水。

 

圖3 清潔和污染的梯度洗脫色譜的比較。

 

      圖3顯示了梯度HPLC對(duì)水質(zhì)的敏感性。表示使用75％甲醇的“梯度”的藥物相關(guān)物質(zhì)方法， 45分鐘后甲醇升高至90％。上面的基線是相同的方法表現(xiàn)出嚴(yán)重的梯度鬼峰，使得分析無用。污染物在第一個(gè)等度周期結(jié)束時(shí)開始突破，最終隨著洗脫液濃度的增加而被洗掉。這種嚴(yán)重系統(tǒng)污染的原因尚未完全確認(rèn)，但強(qiáng)烈懷疑是由于一個(gè)被忽視和細(xì)菌感染的凈水器系統(tǒng)造成的。雜質(zhì)的保留范圍非常廣，與細(xì)菌污染產(chǎn)生的各種物質(zhì)相當(dāng)。當(dāng)細(xì)菌被破壞時(shí)，它們的聚合分泌物和脂多糖細(xì)胞碎片仍保留在水中，這可能包括不容易通過吸附方法去除的極性物質(zhì)。如果長時(shí)間連續(xù)使用高含水溶劑，細(xì)菌的“生物膜”可能會(huì)在儀器和管道內(nèi)形成。高效液相色譜溶劑入口過濾器應(yīng)定期更換或徹底清洗，因?yàn)檫@些過濾器的高表面積使其成為細(xì)菌的“迷宮般的避難所”。用純甲醇或乙腈定期沖洗高含水溶劑管線將有助于限制微生物生長，用二氯甲烷進(jìn)一步?jīng)_洗將完全去除系統(tǒng)中的任何脂質(zhì)和油脂。

 

      遇到的主要生物是革蘭氏陰性菌(例如假單胞菌屬)。)它可以在純水中生存和生長，并在磷酸鹽或醋酸鹽等的存在下茁壯成長。它們?cè)?0-35℃下快速生長，只需幾天就能在高效液相色譜洗脫液中檢測到。低溫儲(chǔ)存會(huì)顯著降低生長，但冷藏高效液相色譜洗脫液通常并不實(shí)用。貝里已經(jīng)表明，即使pH 9緩沖液也不足以阻止生長。

 

       我們自己的微生物學(xué)家建議使用至少15%甲醇的混合物來抑制細(xì)菌生長，其他人建議使用至少5%甲醇或乙腈。貝里曾提到使用0.04%(重量/體積)和0.00004%(重量/體積)之間的疊氮化鈉作為水緩沖液中的抗菌劑，盡管由于儲(chǔ)備溶液易于分解，多蘭曾描述過制備0.004%(重量/體積)(0.4克在10升水洗脫液中)以便在低至210納米的檢測波長下有效使用。有些細(xì)菌對(duì)二氧化氯、季銨化合物和0.25%乙酸有抵抗力。通常，它們可以適應(yīng)惡劣的條件，因此流動(dòng)相玻璃器皿應(yīng)該定期用有機(jī)溶劑清洗并完全干燥，而不是例行地用洗脫液“加滿”。

 

       細(xì)菌鬼峰問題的其他例子包括在高效液相色譜泵“密封-清洗”溶液中出現(xiàn)細(xì)菌生長情況。50:50乙腈：水密封清洗溶液的有機(jī)含量因蒸發(fā)而降低，隨后細(xì)菌生長。用新鮮混合物替換“輕微混濁”的密封清洗溶液，可以完全去除色譜中的鬼峰。此外，絕不能使用實(shí)驗(yàn)室洗瓶來補(bǔ)充高效液相色譜洗脫液的水量。這種水不僅會(huì)被洗瓶塑料的提取物浸透，而且微生物的繁殖旺盛。

 

      筆者也曾經(jīng)遇到水產(chǎn)生鬼峰的例子。在與工廠進(jìn)行分析方法轉(zhuǎn)移時(shí)，有關(guān)物質(zhì)的基線峰出現(xiàn)巨大干擾，(見下兩圖)，經(jīng)排查后發(fā)現(xiàn)正常的基線圖譜為娃哈哈純凈水，工廠采用車間自己生產(chǎn)的注射用水，取來后放置了兩天，導(dǎo)致出現(xiàn)異常。

 

2、水中的無機(jī)雜質(zhì)

 

      現(xiàn)代反相高效液相色譜柱使用超純(B類：酸洗或C類：:合成)二氧化硅，其痕量金屬離子非常低。色譜柱的性能取決于保持這種低金屬離子含量。用于梯度高效液相色譜的水必須完全去離子和純化，這不僅是為了色譜柱，也是因?yàn)殡x子含量會(huì)對(duì)梯度基線產(chǎn)生影響。圖4顯示了去離子水和純凈水不足如何影響梯度基線的斜率。無保留的紫外吸收陰離子(如亞硝酸鹽、硝酸鹽)最有可能是吸光度變化的原因。

 

圖4 梯度基線是用Elga Maxima凈化后的水和(2)單獨(dú)反滲透凈化的水獲得的。

 

3、有機(jī)溶劑

 

      正如多蘭建議有機(jī)溶劑中的雜質(zhì)會(huì)集中在反相高效液相色譜柱上，然后通過痕量富集和聚焦機(jī)制洗脫，這似乎不合邏輯。然而，必須記住，在梯度的早期，溶劑混合物具有相對(duì)較低的總洗脫強(qiáng)度，因此來自有機(jī)溶劑的雜質(zhì)仍然可以以相同的方式保留和洗脫。事實(shí)上，已經(jīng)表明，一些雜質(zhì)可以被80%的有機(jī)物強(qiáng)烈保留，并且在90-100%有機(jī)物時(shí)作為鬼峰洗脫。認(rèn)識(shí)到這一點(diǎn)后，我們才認(rèn)為有機(jī)溶劑質(zhì)量是一個(gè)重要問題。事實(shí)上，不同供應(yīng)商之間，甚至產(chǎn)品批次之間的質(zhì)量差異可能非常大。圖5說明了我們?cè)诠?yīng)梯度級(jí)甲醇時(shí)遇到的一個(gè)問題。

 

       特定甲醇批次的兩個(gè)獨(dú)立瓶給出空白梯度色譜圖，顯示嚴(yán)重污染的上痕量。然而，五個(gè)不同批次的甲醇給出了干凈的空白，如較低的痕量所示；所有其他色譜條件都相同。當(dāng)時(shí)，供應(yīng)商自己對(duì)污染批次的質(zhì)量控制測試實(shí)際上表明它是干凈的，盡管測試程序是合適的，但批次污染發(fā)生在測試后的某個(gè)時(shí)間，大概是在裝瓶過程中。自該事件以來，供應(yīng)商實(shí)施了改進(jìn)的制造和質(zhì)量保證控制，以防止再次發(fā)生事故。然而，這個(gè)例子說明了梯度液相色譜對(duì)商業(yè)供應(yīng)材料質(zhì)量的敏感性。除非供應(yīng)商意識(shí)到微量污染的問題，并且有一些有效的方法來防止不合適的產(chǎn)品單元到達(dá)消費(fèi)者手中，否則劣質(zhì)材料批次可能仍然會(huì)有。

 

圖5 受污染和清潔的甲醇批次的比較圖

 

       布里斯托爾描述了一種高效液相色譜方法，用于區(qū)分鬼峰是來自水還是二元體系的有機(jī)溶劑。為了評(píng)估源自水性組分的雜質(zhì)，必須將不同體積的100%水(或水性緩沖液)加載到柱上然后運(yùn)行一個(gè)梯度，尋找鬼峰高度的增加。如果裝載90%的水和10%的有機(jī)溶劑，平衡時(shí)間加倍會(huì)使兩種溶劑的雜質(zhì)裝載加倍，沒有給出有用的信息。通過首先用10%有機(jī)洗脫液平衡系統(tǒng)，然后用30%有機(jī)洗脫液平衡系統(tǒng)后獲得的梯度色譜圖，可以突出有機(jī)溶劑的鬼峰。源自有機(jī)溶劑的鬼峰在從30%有機(jī)物開始的梯度中將更大。鬼峰尺寸的增加不是直接成比例的，因?yàn)殡s質(zhì)負(fù)載在梯度的早期也在一定程度上發(fā)生(見圖7)。

 

圖7 測定水和乙腈中雜質(zhì)引起的洗脫液鬼峰的來源

 

      標(biāo)記為“溶劑畸變”的峰來自于將乙腈引入純水系統(tǒng)所引起的物理混合效應(yīng)(或除氣作用，見下文)。該峰形狀不典型，其面積不會(huì)隨100%水的額外負(fù)荷而變化；其他水雜質(zhì)峰的尺寸加倍。這些色譜圖中有趣的特征是，一般來說，源于水的鬼峰往往出現(xiàn)在色譜圖的早期，而源于有機(jī)溶劑的鬼峰往往出現(xiàn)在后期。同樣值得注意的是，30%有機(jī)物的起始混合物具有0%或10%起始條件更平滑的基線，因?yàn)榛旌衔镆呀?jīng)太強(qiáng)而不能有效地聚焦更親水的水雜質(zhì)。

 

備注：筆者在實(shí)際過程會(huì)經(jīng)常遇到各個(gè)有機(jī)溶劑供應(yīng)商之間的差異，在進(jìn)行分析方法開發(fā)或者方法轉(zhuǎn)移時(shí)都需要關(guān)注。

 

       四氫呋喃是梯度高效液相色譜中非常有用的溶劑改性劑。它與水的紫外失配通常太大，不能單獨(dú)使用，紫外截止值為212nm，但在甲醇或乙腈梯度下的恒定水平(1-10%)下，它可以具有很大的選擇性效果。與其他溶劑一樣，市售THF級(jí)高效液相色譜(不穩(wěn)定)的質(zhì)量是可變的，一些所謂的THF高效液相色譜劑供應(yīng)品根本不足以滿足梯度高效液相色譜的要求。如果使用穩(wěn)定劑BHT (2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)，BHT很容易在梯度中間形成典型的峰被觀察到。

 

      總之，適用于梯度高效液相色譜的合適質(zhì)量的溶劑是可用的，但是人們需要對(duì)質(zhì)量保持警惕，并且人們可能必須檢查來自幾個(gè)供應(yīng)商的溶劑以找到最好的。

 

4、流動(dòng)相試劑和添加劑

 

       如果梯度色譜圖包含鬼峰，并且已知水和有機(jī)溶劑通常具有良好的純度，那么任何緩沖劑都是下一個(gè)可疑的。流動(dòng)相越復(fù)雜，雜質(zhì)和鬼峰出現(xiàn)的幾率就越大。如果懷疑有添加劑，洗脫液應(yīng)省略添加劑，以測試其對(duì)問題的貢獻(xiàn)。磷酸鹽和醋酸鹽的純度范圍很廣，許多不適合梯度高效液相色譜。用前述聚苯乙烯二乙烯基苯圓盤過濾含水緩沖組分在這里可能是合適的。市售三氟乙酸的質(zhì)量也是可變的，試劑隨著時(shí)間而氧化；老化TFA經(jīng)常呈現(xiàn)淺棕色。圖9顯示了源自所用TFA的大約13.5分鐘處的相當(dāng)大的鬼峰。與高效液相色譜溶劑一樣，我們努力購買最好質(zhì)量的試劑。我們目前發(fā)現(xiàn)甲酸對(duì)于低酸堿度應(yīng)用來說是一種更清潔的試劑。

 

圖9不同等級(jí)三氟乙酸的比較

 

備注：在流動(dòng)相中經(jīng)常用到離子對(duì)試劑，如十二烷基硫酸鈉等，這些離子對(duì)的質(zhì)量需要在實(shí)驗(yàn)過程中予以關(guān)注，經(jīng)常會(huì)在由于質(zhì)量原因造成鬼峰。

 

5、鄰苯二甲酸酯、塑料添加劑（如pH計(jì)）和空氣中的有機(jī)物作為鬼峰

 

       梯度高效液相色譜的洗脫液絕不能保存在塑料容器中。塑料中可能含有軟化劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑或顏色，這些物質(zhì)可能會(huì)從材料中滲出并導(dǎo)致鬼峰問題。Gabler等人觀察到，僅在一小時(shí)后，梯度鬼峰雜質(zhì)從聚乙烯和聚丙烯容器中浸出到純水中。對(duì)于梯度高效液相色譜，也不能用塑料量筒、移液管和洗瓶。尼爾森和多蘭報(bào)道說，當(dāng)一個(gè)酸度計(jì)探頭插入到緩沖水溶液中時(shí)，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的鬼峰污染。雖然正如作者所指出的，最好取一小份洗脫液來測量酸堿度，而不是直接將酸堿度計(jì)探針插入流動(dòng)相中，但雜質(zhì)的確切來源尚未確定。

 

      鄰苯二甲酸酯是在樹脂和聚合物中用作增塑劑的半揮發(fā)性液體。在聚氯乙烯中，它們可能存在于60%以上。自20世紀(jì)40年代以來，鄰苯二甲酸酯每年以數(shù)百萬噸的規(guī)模生產(chǎn)，現(xiàn)在廣泛分布在世界各地，幾乎在地球的所有表面都能檢測到，甚至在北極圈內(nèi)的濃度也在0.1至20納克/米之間。

 

       它們已在各種實(shí)驗(yàn)室材料中檢測到，包括蒸餾水、溶劑、實(shí)驗(yàn)室空氣、玻璃器皿、瓶蓋、二氧化硅、氧化鋁、濾紙、鋁箔紙、硅藻土、試劑如硫酸鈉、氯化鈉、碳酸鈣和離子交換材料。DEHP(鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯)在空氣中的實(shí)驗(yàn)室濃度可能高達(dá)35納克/米，取決于使用的材料。

 

      使用LCMS，我們?cè)谑褂靡译婧图状嫉母咝б合嗌V梯度色譜中檢測到鄰苯二甲酸二辛酯異構(gòu)體作為梯度鬼峰。

 

 

圖10 梯度色譜顯示梯度高效液相色譜級(jí)乙腈中鄰苯二甲酸二辛酯的污染。

 

6、流動(dòng)相玻璃器皿的污染

 

      未經(jīng)處理的玻璃具有活性表面，很難去除吸附的污染物，尤其是洗滌劑殘留物。尼爾森和多蘭報(bào)告了這些問題，并最終推薦用自來水沖洗玻璃器皿10次，用去離子水沖洗10次，以獲得滿意的結(jié)果。我們也經(jīng)歷過類似的困難，但建議使用非常熱的自來水、純水和有機(jī)溶劑。(熱水似乎有助于釋放長鏈洗滌劑。)張和他的同事還發(fā)現(xiàn)洗滌劑殘留物干擾了甘油三酯檢測，并報(bào)告說，它們通過多次水洗或稀釋鹽酸沒有被去除。人們可以想象，在所有這些情況下，水的“硬度”可能會(huì)有一些影響，硬水清洗可能會(huì)更成功。

 

       玻璃仍然是容納梯度高效液相色譜溶劑的最合適的材料，但是將流動(dòng)相玻璃器皿通過洗滌劑清洗程序如許多公司一樣，只會(huì)使玻璃器皿比其他情況下更臟。對(duì)于高效液相色譜洗脫液，我們現(xiàn)在只使用純水(如果使用鹽)和干凈的有機(jī)溶劑沖洗玻璃器皿。這適用于洗提液瓶、量筒、移液管和任何其他用于洗提液制備的玻璃器皿。

 

備注：高效液相色譜分析中使用的進(jìn)樣小瓶也是玻璃的，不同廠家的之間的質(zhì)量也會(huì)不一樣。如果不是一次性使用，防止污染以及玻璃材質(zhì)中雜質(zhì)的浸出、內(nèi)容物與玻璃材質(zhì)之間的作用也是出現(xiàn)鬼峰時(shí)的重點(diǎn)考慮對(duì)象。

 

二、鬼峰的其他來源

 

1、第一個(gè)原因是在梯度洗脫條件較晚且較強(qiáng)的情況下，固定相的“流失”增加。

 

      這種效應(yīng)更常見于全氟化和苯基型固定相。圖11中的例子是與使用標(biāo)準(zhǔn)C18相的相同系統(tǒng)的第一次注射相比，使用全氟化固定相的運(yùn)行的第一次注射。在這兩種情況下，允許系統(tǒng)在運(yùn)行開始前靜置幾個(gè)小時(shí)。固定相流失在梯度末端聚焦成一個(gè)寬峰。

 

圖11 靜置數(shù)小時(shí)后，使用全氟化柱(上痕量)和C18柱(下痕量)首次注射序列。隨后注射全氟化柱顯示出血較少。

 

      根據(jù)流失率率和色譜方法，該問題可能僅在第一次注射時(shí)出現(xiàn)，在隨后的注射中幾乎不明顯，或者可能在序列的所有注射中出現(xiàn)。

 

2、泵送和混合問題

 

      在一些梯度方法中，在開始梯度之前，需要等度流動(dòng)相一段時(shí)間。分析師可以選擇如何實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，并且這樣做的方式會(huì)對(duì)梯度基線產(chǎn)生不同尋常的影響。圖12中的梯度方法需要75%甲醇的流動(dòng)相45分鐘，然后在一分鐘內(nèi)變?yōu)?0%甲醇，然后等度保持14分鐘。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的兩種潛在方法是：(1)制備75%甲醇的洗脫液A和90%甲醇的洗脫液B，并將溶劑輸送從100% A改為100% B(上圖)。 (2)將洗脫液A配制成100%水，洗脫液B配制成100%甲醇，用儀器混合75%和90%的溶劑。(較低的軌跡。)

 

圖12 混合相同洗脫劑組合物的不同方法

 

      如果流動(dòng)相如情況(1)中那樣被預(yù)混合，則在55分鐘觀察到不尋常的鬼峰。這種效應(yīng)在各種儀器上都能看到，通常在一個(gè)序列中的所有注射中都是相同的，但并不總是如此。它有時(shí)表現(xiàn)為正方形，有時(shí)表現(xiàn)為一兩個(gè)峰，因此需要很長時(shí)間來確定這個(gè)問題的根源。該系統(tǒng)只有一個(gè)泵和一個(gè)低壓混合閥，似乎洗脫液B的閑置和延遲啟動(dòng)是觀察到的像差的原因。

 

      可能的原因可能包括閥門泄漏或故障、溶解氣體問題或某些物質(zhì)進(jìn)出流動(dòng)相。高壓混合系統(tǒng)在溶劑步驟中也給出了相當(dāng)大的鬼峰，但是沒有如低壓系統(tǒng)所見的延遲像差。很明顯，在這種情況下，最好保持兩條溶劑管線的一些連續(xù)混合活性，而不是讓其中一條保持靜止。

 

3、注射和流動(dòng)相脫氣產(chǎn)生的“空氣峰”

 

      看起來與真實(shí)分析物峰幾乎相同的假峰可能是由于無意中向系統(tǒng)中注入空氣造成的。

 

      在許多儀器上，在抽取樣本后，針尖上可能會(huì)出現(xiàn)一小塊空氣，在失效的注射器中，這可能會(huì)由于虹吸效應(yīng)而加劇，虹吸效應(yīng)會(huì)將更多的空氣吸入注射器。除非注入非常大量的空氣，否則以這種方式注入的空氣將在系統(tǒng)壓力下立即被壓縮并溶解到流動(dòng)相中。流動(dòng)相的富氣塞將會(huì)以與化學(xué)分析物帶相同的方式沿色譜柱縱向擴(kuò)散。被空氣飽和的流動(dòng)相比脫氣的流動(dòng)相具有更高的吸收率，因此可以觀察到氣體飽和的流動(dòng)相峰，其看起來非常像真實(shí)的分析物峰

 

圖13 上圖顯示梯度系統(tǒng)色譜圖(甲醇，265納米)，在線脫氣效率低。用氦氣吹掃洗脫液后，產(chǎn)生較低的痕量。

 

      也報(bào)道了充氣樣品溶劑出現(xiàn)相同問題。樣品溶劑和流動(dòng)相之間未溶解氣體(特別是氧氣)的量的差異產(chǎn)生相同的特征空氣峰。溶解空氣峰可能表現(xiàn)出顯著的保留，保留時(shí)間為t0的2-3倍，這使得問題的識(shí)別非常困難。可以通過觀察脫氣樣品注入時(shí)峰大小的變化來確認(rèn)空氣峰問題。

 

       我們偶爾會(huì)遇到的另一個(gè)麻煩問題是不典型的“魚翅”形狀的峰，它具有尖銳的前沿，然后幾乎線性下降到基線。這種類型的鬼峰也在文獻(xiàn)中有報(bào)道。根據(jù)問題的嚴(yán)重程度，峰值的大小可能很小(僅1-10毫安)或很大(高達(dá)1毫安)。圖13顯示了18分鐘內(nèi)55-95%甲醇(265nm)的梯度。

 

      上面的軌跡顯示了幾個(gè)魚翅狀的峰，這是由于在線脫氣器效率低造成的。較低的痕量是在用氦氣噴射溶劑后產(chǎn)生的。(本例中相當(dāng)嘈雜的基線是由于輸送系統(tǒng)中溶劑混合不良造成的)。這些峰值是由瞬時(shí)壓降引起的，而不是雜質(zhì)。空氣氣體在純水和純有機(jī)溶劑中的溶解度通常大于兩者的混合物。因此，當(dāng)空氣飽和溶劑混合時(shí)，混合物對(duì)溶解氣體的容量往往較低，并且會(huì)發(fā)生“脫氣”。

 

       在低壓混合系統(tǒng)中(溶劑在泵前混合)，這可能會(huì)導(dǎo)致氣泡出現(xiàn)在泵內(nèi)，從而導(dǎo)致壓降和吸光度的變化，檢測器會(huì)立即記錄下來。隨后通常是壓力的穩(wěn)定恢復(fù)，因此是線性拖尾。在圖13中不同程度地觀察了前一種情況幾次。在嚴(yán)重的情況下，氣泡可能導(dǎo)致泵完全失效。(高壓系統(tǒng)通常不會(huì)觀察到這種現(xiàn)象，因?yàn)槿軇┰谶M(jìn)入泵之前不會(huì)混合。)在魚翅峰之后，空氣可以通過與前面描述的相同的機(jī)制呈現(xiàn)為空氣峰。除了流動(dòng)相脫氣外，我們通常在檢測器之后廢液管線中添加30-40厘米的PEEK管。這增加了幾磅/平方英寸的壓力，并且在檢測器之后減少柱后排氣的趨勢。

 

4、注射殘留

 

       如果含有高度保留成分的樣品被注入到梯度系統(tǒng)中，而該梯度系統(tǒng)在其終點(diǎn)沒有充分洗脫，那么這些成分可能在隨后的注射過程中被洗脫。為了避免這個(gè)問題，分析員必須努力確保梯度系統(tǒng)運(yùn)行到足夠的溶劑濃度，以便在一次運(yùn)行中洗脫所有樣品成分。梯度系統(tǒng)的峰值聚焦能力可能會(huì)也可能不會(huì)將殘留峰帶到正常的分析物峰寬。通過將梯度運(yùn)行到更高濃度的有機(jī)溶劑，或者通過在梯度末端應(yīng)用更長的等度保持，可以容易地識(shí)別這個(gè)問題。

 

5、系統(tǒng)樣本污染

 

      與空氣峰一樣，樣品污染可能會(huì)在等度和梯度高效液相色譜中導(dǎo)致鬼峰。Strasser和Varadi最近報(bào)告了兩個(gè)出現(xiàn)鬼峰的例子——被注入樣品溶液污染的隔墊。他們發(fā)現(xiàn)，在用聚四氟乙烯-橡膠隔墊覆蓋的樣品瓶的第二次和隨后的注射中觀察到鬼峰，而使用更惰性的聚四氟乙烯-硅-聚四氟乙烯隔墊觀察到的鬼峰更少。第一次注射導(dǎo)致聚四氟乙烯膜破裂，使小瓶中的內(nèi)容物暴露在橡膠隔膜的可萃取和可檢測成分中。

 

       在第二個(gè)例子中，他們發(fā)現(xiàn)用于植物清洗驗(yàn)證的拭子樣本被植物操作者使用的乳膠橡膠手套的提取物污染。為了避免這種情況，在分析方法中規(guī)定了認(rèn)可的手套類型。

 

6、流動(dòng)相組分與固定相相互作用產(chǎn)生的鬼峰

 

      虛峰和“空位峰”可以通過與固定相相互作用的流動(dòng)相組分的吸附或位移來觀察。隨著流動(dòng)相和注射溶劑的復(fù)雜性增加，通常在色譜開始時(shí)觀察到的系統(tǒng)峰的復(fù)雜性也會(huì)增加。這種系統(tǒng)峰通常并不局限于非常靠近注射前沿，也不局限于大多數(shù)分析人員希望具有分析物的保留因子。文獻(xiàn)中討論了這些系統(tǒng)擾動(dòng)的原因，包括用含有TFA和較大離子對(duì)試劑的系統(tǒng)觀察到的注射前沿效應(yīng)。

 

三、如何避免鬼峰

 

      有時(shí)，盡管人們完全理解并盡最大努力去除梯度高效液相色譜鬼峰，但仍然不可能完全去除它們。如果可用的水、有機(jī)溶劑和試劑不夠好，不能進(jìn)一步純化，或者儀器不能做得更好，仍有一些方法可以將鬼峰的嚴(yán)重性降至最低。

 

1、如果您的分析允許，較高的檢測波長通常會(huì)導(dǎo)致較少的溶劑混合鬼峰、溶解的空氣峰和低波長洗脫液雜質(zhì)。

 

2、避免溶劑組成的低極限意味著親水流動(dòng)相雜質(zhì)不會(huì)隨著梯度的進(jìn)展而聚集，基線通常更平滑。

 

3、清潔玻璃器皿和儀器。如前所述，流動(dòng)相玻璃器皿只能用純水(如果使用鹽)清洗，然后清洗有機(jī)溶劑出口。如果檢測到儀器受到細(xì)菌污染，則需要進(jìn)行一些強(qiáng)力清洗，尤其是在高含水洗脫液已經(jīng)使用很長時(shí)間的情況下。要去除微生物殘留物，取下色譜柱并沖洗系統(tǒng)(但不沖洗檢測器！)用0.5M氫氧化鈉溶液，然后用適量的水。然后，通過用100%甲醇沖洗所有溶劑管線，接著用100%二氯甲烷沖洗，然后再用100%甲醇沖洗，可以有效地對(duì)儀器進(jìn)行“脫脂”。

 

4、常規(guī)空白注射在反相梯度高效液相色譜中至關(guān)重要。它們對(duì)系統(tǒng)的清潔度和性能進(jìn)行定期檢查，并有助于集中精力解決棘手的鬼峰問題。最終，可能必須選擇性地從樣品色譜圖的積分中忽略鬼峰。

 

5、電子基線減法如果鬼峰在與樣品組分峰相似的保留時(shí)間出現(xiàn)，或者在可能出現(xiàn)的地方出現(xiàn)，則鬼峰可能會(huì)造成相當(dāng)大的問題。繞過這個(gè)問題并同時(shí)校正基線漂移的一種方法是使用電子基線減法，但是在目前，使用這種技術(shù)的方法應(yīng)該逐案驗(yàn)證。一般不建議使用。

 

備注：目前有種比較簡單的方式：鬼峰補(bǔ)集柱