前言

當前，隨著國內生物醫藥的快速發展，越來越多的生物制藥企業的產品研發進入產業化階段。在生物制藥領域里，質量源于設計（QbD)是一種系統化、結構化、基于科學和風險的藥品研發方法，是一種對產品、工藝和分析方法進行科學有效管理的重要工具。目前單抗領域是生物制藥行業發展最快，也是相對成熟的領域之一，關于QbD的在單抗制品的開發中應用的報道越來越多，本文簡述了單抗制品細胞培養生產工藝中應用QbD的概念和初步想法。

細胞培養生產工藝

抗體藥物的原液生產大體可分為上游工藝（又稱細胞培養）、下游工藝（又稱純化）2個環節，每個環節都擁有其核心技術，這些核心技術環環相扣，形成了抗體藥物生產企業的核心競爭力。一個典型的單抗藥物的商業化生產流程-上游工藝（細胞培養）一般采用以下步驟：細胞復蘇與傳代→擴增培養→細胞大規模培養→細胞分離（可屬于下游工藝）。

01細胞復蘇與傳代

將種子放置在恒溫的水浴鍋中，一般溫度控制在如35℃左右，預熱如30min，將工作細胞庫細胞進行解凍復蘇，根據工藝要求控制解凍時間，然后將解凍細胞加入至培養基中，離心分離后轉入搖瓶中（如250 mL），進行搖瓶傳代。注意控制CO2濃度、培養溫度、培養時間等因素，同時也要根據工藝的要求控制接種的密度，控制細胞活率等要求。將上述的復蘇種子細胞按照一定的密度稀釋至新搖瓶中（如500 mL/2000mL），控制溫度、CO2濃度、溶氧濃度、培養溫度、培養時間、搖床搖擺速度、pH等因素，逐漸擴增細胞數量至滿足一級種子罐的接種要求。

02擴增培養（亦稱種子培養）

一級種子培養

將搖瓶種子細胞按照一定的密度接種到一級種子罐內（如20 L），控制溫度、CO2濃度、溶氧濃度、培養溫度、培養時間、攪拌速度、pH、培養基等因素，逐漸擴增至細胞數量滿足二級種子罐的要求。

二級種子培養

將一級種子按照一定的密度接種到二級種子罐內（如50 L），控制溫度、CO2濃度、溶氧濃度、培養溫度、培養時間、攪拌速度、pH、培養基等因素，逐漸擴增至細胞數量滿足三級種子罐的接種要求。

三級種子培養

將二級種子按照一定的密度接種到三級種子罐內（如100 L），控制溫度、CO2濃度、溶氧濃度、培養溫度、培養時間、攪拌速度、pH、培養基等因素，逐漸擴增至細胞數量滿足細胞發酵培養的接種要求。

03細胞大規模培養（亦稱生物反應器細胞培養）

種子擴增后要進入細胞大規模培養階段，注意控制溫度、CO2濃度、溶氧濃度、培養溫度、培養時間、攪拌速度、pH、培養基等因素。細胞培養結束后，可采用離心分離或澄清過濾等方法進行抗體蛋白的分離純化。

基于QbD理念的細胞培養工藝開發

質量源于設計（QbD) 核心理念在于“質量是通過科學合理的設計得以實現的，而不是僅僅依靠最終檢驗出來的”。自2013年起，美國 FDA 對于新的藥品批準申請，監管部門均要求采用QbD方法。近年來，QbD的理念已逐漸成為國內企業大多數藥品生產和研發企業共識，在單抗制品的細胞培養工藝開發中應用的報道越來越多，基于QbD理念的藥品開發基本流程，ICH Q8中提到的質量源于設計QbD的方法如下圖所示：

基于QbD理念的細胞培養工藝開發：首先要界定目標產品的質量概況（QTPP），即以預先設定的目標產品質量概括（QTPP）為研發的起點，在了解關鍵物質屬性（CMA）的基礎上，通過試驗設計（DOE），理解產品的關鍵質量屬性（CQA），確立關鍵工藝參數（CPP），在原料特性、工藝條件、環境等多個影響因素下，建立能滿足產品性能的且工藝穩健的設計空間（DS），并根據設計空間，建立質量風險管理，確立質量控制策略和藥品質量體系，整個過程強調對產品和生產的認識。QbD可以幫助我們更好地理解產品和工藝，增強單抗制品的穩定性，降低GMP生產的復雜性和成本等。

那么細胞培養過程中設計空間如何確定一直是大家都感興趣的話題，自從2021年6月25日，CDE發布實施《已上市生物制品藥學變更研究技術指導原則（試行）》，正式在官方指導原則提到設計空間的概念，一石激起千層浪，下面我就來分享一下細胞培養過程中設計空間確定的流程，因為個人認知的局限性，如有不足，歡迎留言補充。細胞培養操作空間一般由申辦者在注冊時提出，監管機構（如CDE）評估和批準，在設計空間的確定過程中，需要量化不同參數對工藝過程產品表現的影響：如產量和質量，按影響程度通常分為非重要工藝參數（Non-KPP），重要工藝參數（KPP）、關鍵工藝參數（CPP），細胞培養過程中設計空間（DS）確定流程一般如下（可供參考），

01評估細胞培養過程中所有工藝過程參數

首先以適當的評估工具（如FMEA）評估細胞培養過程中所有工藝過程參數，確定細胞培養工藝表征中需要研究的參數，因不同生物制品自身特點不同，細胞培養過程中工藝過程參數也會有所差別，評估后的工藝表征中需要研究的參數也會有所差別。因此相關研究人員須具備足夠的培養工藝知識積累、風險評估和風險管控的能力。在實施評估時，基于風險，前瞻性設計研究方案，開展充分的研究，不同階段細胞培養，評估的參數對象也會有所差別，一般情況下分細胞復蘇與傳代、各級種子培養、細胞大規模培養分別進行評估細胞培養過程相關工藝過程參數，如某藥企大規模生產階段細胞培養過程相關工藝過程參數如下表：

02建立工藝縮小模型

其次建立工藝縮小模型；在縮小模型基礎上，進行試驗設計（DOE）參數篩選實驗，去除非重要工藝參數（Non-KPP），確定重要工藝參數（KPP），對影響產品質量的參數進行響應曲面設計（RSM）實驗設計，建模，確定關鍵工藝參數（CPP）操作空間，如在風險評估階段確定了生產培養步驟中的4個潛在的關鍵工藝參數（CPP）(IVCD、Culture duration、pH和Temperature)，最后進行最差條件實驗進行操作空間確認，確認的范圍如下表：