本文主要介紹了武漢艾米森生命科技有限公司研發(fā)的醫(yī)療器械“SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒（熒光PCR法）”的臨床前研發(fā)實(shí)驗(yàn)。

一、SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒的產(chǎn)品主要組成成分

表 1 試劑盒主要組成成分

二、SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒的產(chǎn)品預(yù)期用途

本產(chǎn)品用于體外定性檢測人糞便樣本中腸道脫落細(xì)胞的SDC2 和 TFPI2 基因的甲基化。 

本產(chǎn)品適用于臨床醫(yī)師建議做腸鏡檢測的患者的輔助診斷，不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據(jù)。檢測結(jié)果僅供臨床參考，具體臨床應(yīng)用時，臨床醫(yī)生必須結(jié)合病例實(shí)際情況判斷。 

陽性結(jié)果需要進(jìn)一步接受腸鏡檢查；陰性結(jié)果表示受檢者體內(nèi)有結(jié)直腸癌和/或進(jìn)展期腺瘤的可能性低，但并不能完全排除疾病風(fēng)險，必要時仍應(yīng)建議進(jìn)行腸鏡檢查。本產(chǎn)品不能替代腸鏡，不能用于普通人群的腫瘤篩查。 

三、SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒的包裝規(guī)格

24 測試/盒、48 測試/盒、96 測試/盒。 

四、SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒的產(chǎn)品檢驗(yàn)原理

本試劑盒采用的技術(shù)原理是甲基化特異性多重 PCR-熒光探針法。 

本產(chǎn)品基于實(shí)時熒光 PCR 技術(shù)實(shí)現(xiàn)對糞便樣本中 SDC2 和TFPI2 基因甲基化的檢測。從人糞便樣本中獲得腸道脫落細(xì)胞基因組 DNA，然后用重亞硫酸鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并通過三重 PCR擴(kuò)增來測定亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的 DNA（bisDNA），從而檢測發(fā)生甲基化的 SDC2 基因 DNA 片段（ROX 信號通道）和 TFPI2 基因 DNA 片段（FAM 信號通道）以及內(nèi)控基因 ACTB（VIC 信號通道）。其中 ACTB（β-Actin）基因?yàn)槌Ｓ霉芗一颍糜谠u估檢測中樣本 DNA 含量和質(zhì)量，在每一次檢測中都同時檢測陽性對照和陰性對照。 

本試劑盒適用的樣本為保存在武漢艾米森生命科技有限公司的細(xì)胞保存液中的糞便樣本，保存液能有效保護(hù)核酸不被降解。糞便樣本中特異性核酸提取的原理是利用偶聯(lián)靶基因探針的磁珠富集相關(guān)靶基因。重亞硫酸鹽的化學(xué)反應(yīng)把沒有發(fā)生甲基化的胞嘧啶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，脫氨基反應(yīng)產(chǎn)生尿嘧啶磺酸鹽。轉(zhuǎn)化的原理是亞硫酸鹽離子通過親核反應(yīng)添加到胞嘧啶上，但是發(fā)生了甲基化的胞嘧啶不會被亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。本產(chǎn)品對于 SDC2和 TFPI2 甲基化檢測，在 SDC2 和 TFPI2 基因啟動子與結(jié)直腸癌發(fā)生高度相關(guān)的 CpG 區(qū)域，針對經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的序列分別設(shè)計了特異性引物和特異性熒光探針，可以在 PCR 反應(yīng)中專一地檢測出甲基化的序列。 

五、SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒的主要原材料的選擇 

該產(chǎn)品的主要原材料包括：引物、探針、Taq 酶和 dNTP，這些原材料均是通過外購的方式獲得。引物和探針均由艾米森自行設(shè)計，由合成公司經(jīng)過合成、修飾和純化后獲得；Taq 酶由原材料供應(yīng)商克隆表達(dá)后獲得；dNTP 由供應(yīng)商化學(xué)合成獲得。艾米森對主要原材料進(jìn)行了供應(yīng)商的選擇，通過功能性實(shí)驗(yàn)篩選出合格供應(yīng)商，制定了各主要原材料的技術(shù)要求和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。

六、SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒的企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況

該產(chǎn)品企業(yè)參考品包括陽性參考品、陰性參考品、精密度參考品以及檢測限參考品。企業(yè)參考品的主要原料為糞便樣本和細(xì)胞系，包括 SDC2基因相應(yīng)位點(diǎn)甲基化陽性的細(xì)胞系、TFPI2 基因相應(yīng)位點(diǎn)甲基化陽性的細(xì)胞系、SDC2 基因和 TFPI2 基因相應(yīng)位點(diǎn)甲基化陰性的細(xì)胞系。這些細(xì)胞系均經(jīng)過數(shù)字PCR及Sanger測序方法驗(yàn)證。

陽性參考品包括 10 種，分別命名為陽性參考品 P1-P10，其中陽性參考品 P1-P3 為一定 DNA 濃度下含不同比例甲基化SDC2 基因的單陽樣本；P4-P6 為一定 DNA 濃度下含不同比例甲基化 TFPI2 基因的單陽樣本；P7-P10 為一定 DNA 濃度下含不同比例甲基化 SDC2 基因和 TFPI2 基因的雙陽樣本。 

陰性參考品包括 10 種，分別命名為陰性參考品 N1-N10。包括添加 SDC2 基因和 TFPI2 基因甲基化陰性細(xì)胞系的糞便樣本、添加 SDC2 基因和 TFPI2 基因甲基化陰性且其他消化道易共存基因甲基化陽性細(xì)胞系的糞便樣本、不同干擾疾病患者糞便樣本、含一定濃度不同干擾物質(zhì)的健康人糞便樣本。 

精密度參考品包括 2 種，命名為精密度參考品 R1 和 R2，為一定 DNA 濃度下含不同比例甲基化 SDC2 基因和 TFPI2 基因的雙陽樣本。 

檢測限參考品包括 3 種，分別命名為檢測限參考品 L1-L3，其中檢測限參考品 L1 為一定 DNA 濃度下含低比例甲基化SDC2 基因的單陽樣本；L2 為一定 DNA 濃度下含低比例甲基化TFPI2 基因的單陽樣本；L3 為一定 DNA 濃度下含低比例甲基化 SDC2 基因和 TFPI2 基因的雙陽樣本。 

本試劑盒設(shè)置了陽性對照質(zhì)控品，為一定濃度的陽性 DNA 樣本，用于檢測過程中試劑和儀器的質(zhì)量控制；此外，每一個反應(yīng)中均檢測內(nèi)參基因 ACTB，用于結(jié)果的判讀及監(jiān)測樣本的質(zhì)量。

七、SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究 

艾米森對試劑盒反應(yīng)體系的研究包括引物探針濃度的確定、Taq 酶濃度的確定、dNTP 濃度的確定、PCR buffer 濃度的確定、陽性對照品濃度的確定、單多重體系的驗(yàn)證等；對 PCR反應(yīng)條件的研究包括預(yù)變性時間、退火溫度和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的優(yōu)化；對樣本的用量以及樣本保存時間進(jìn)行了研究；對檢測結(jié)果的閾值和基線進(jìn)行了研究。通過功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。 

艾米森根據(jù)試劑盒中試劑及組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。 

八、SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒的分析性能評估研究

該產(chǎn)品分析性能評估內(nèi)容包括準(zhǔn)確度、精密度、分析靈敏度、分析特異性、不同包裝規(guī)格性能的研究和核酸提取試劑及核酸純化試劑性能研究，同時對糞便樣本穩(wěn)定性、糞便樣本核酸提取液穩(wěn)定性、糞便樣本核酸轉(zhuǎn)化液穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。 

準(zhǔn)確度研究中，艾米森分別用三批試劑盒在三種適用機(jī)型上對陰性參考品和陽性參考品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示陰性參考品符合率、陽性參考品符合率均為 100%。同時使用若干臨床樣本對試劑盒準(zhǔn)確性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示試劑盒檢測結(jié)果與Sanger 測序結(jié)果一致。 

精密度研究中，艾米森使用不同濃度和不同甲基化比例的臨床樣本，分別對三批次試劑盒在三種適用機(jī)型上由兩位操作者在20天進(jìn)行連續(xù)的檢測。結(jié)果顯示試劑盒對臨床樣本的批內(nèi)、日內(nèi)、運(yùn)行間、批次間、日間、人員間、設(shè)備間和實(shí)驗(yàn)室間的檢測變異系數(shù)均小于等于 5%。 

分析靈敏度研究中，艾米森配制不同濃度、不同甲基化比例的模擬樣本，每濃度梯度使用三批試劑盒分別在三種適用機(jī)型上檢測 20 次，將檢出率大于等于 95%的最低濃度水平確定為最低檢測限；檢測限的驗(yàn)證為使用連續(xù)生產(chǎn)的三批試劑盒在三種適用機(jī)型上對最低檢測限濃度水平的臨床樣本檢測 20 次。檢測結(jié)果顯示該產(chǎn)品的最低檢測限為1×104 copies/µL野生型DNA背景下 1%的 SDC2 和TFPI2 甲基化 DNA。 

分析特異性研究包含交叉反應(yīng)研究和干擾研究：交叉反應(yīng)研究中，用三批試劑盒檢測轉(zhuǎn)化前的結(jié)直腸癌糞便樣本、非目標(biāo)的其他結(jié)直腸癌相關(guān)基因甲基化陽性的糞便樣本和常見腸道微生物樣本，均無交叉反應(yīng)；用三批試劑盒檢測其他惡性腫瘤患者糞便樣本，包括胃癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌、尿路上皮癌、前列腺癌、宮頸癌、甲狀腺癌和肺癌共 10 種惡性腫瘤，結(jié)果顯示，該產(chǎn)品與胃癌、食管癌、胰腺癌、尿路上皮癌、前列腺癌、宮頸癌存在一定的交叉反應(yīng)，與其他惡性腫瘤無交叉反應(yīng)。同時進(jìn)行了風(fēng)險分析。干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示，糞便樣本中分別含有以下干擾物：1.07 mg/mL 布洛芬、1.2 mg/mL 黃連素、12 mg/mL 蒙脫石散、0.27 mg/mL 頭孢、2 mg/mL 通便靈、0.04 mg/mL 嗎丁啉、0.8 mg/mL 氧氟沙星、0.83 mg/mL 開塞露、4 mg/mL 痔瘡膏、0.16 mg/mL 奧美拉唑、4 mg/mL 硬脂酸、2 mg/mL 軟脂酸、100 μg/mL 動物 DNA、100 μg/mL 植物 DNA、30 mg/mL 甘油三酯、60 mg/mL 血紅蛋白、20 mg/mL 膽紅素均不干擾本試劑盒的檢測結(jié)果。 

使用三批不同包裝規(guī)格（24 測試/盒，48 測試/盒，96 測試/盒）的試劑盒進(jìn)行陰性參考品符合率、陽性參考品符合率、檢測限和精密度研究，結(jié)果表明，該產(chǎn)品不同包裝規(guī)格檢測結(jié)果性能無差異。 

艾米森采用臨床糞便樣本進(jìn)行了核酸提取試劑性能研究和核酸純化試劑性能研究，并根據(jù)與該產(chǎn)品的組合性能研究結(jié)果，確定推薦的核酸提取試劑和核酸純化試劑符合檢測要求。 

九、SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒的陽性判斷值或參考區(qū)間研究 

該產(chǎn)品陽性判斷值的研究采用臨床來源糞便樣本。474 例樣本包括結(jié)直腸癌患者樣本、進(jìn)展期腺瘤樣本、非進(jìn)展期腺瘤樣本、結(jié)直腸息肉樣本、結(jié)直腸炎癥樣本、淋巴瘤樣本、胃息肉樣本、胃炎樣本、神經(jīng)內(nèi)分泌癌樣本、食管瘤樣本、痔瘡樣本、其他消化系統(tǒng)良性疾病樣本、腸道無異常樣本。 

采用百分位數(shù)法確定內(nèi)標(biāo)基因的 Ct 值范圍，采用 ROC 曲線法確定靶標(biāo)基因陽性判斷值。內(nèi)標(biāo)基因 Ct 值≤36 時判定為樣本合格；在確定樣本檢測結(jié)果有效的情況下，確定了 SDC2 和TFPI2 基因的 Cutoff 值均為 Ct≤38。當(dāng) SDC2 基因和 TFPI2 基因的 Ct≤38 時判斷為對應(yīng)基因陽性；當(dāng) SDC2 基因和 TFPI2 基因的 Ct 值＞38 或顯示 Unde 時判斷為對應(yīng)基因陰性。樣本檢測結(jié)果中，SDC2 基因和 TFPI2 基因任一基因?yàn)殛栃詣t樣本為陽性， SDC2 基因和 TFPI2 基因同時為陰性則樣本為陰性。 

十、SDC2和TFPI2基因甲基化聯(lián)合檢測試劑盒的穩(wěn)定性研究

艾米森對該產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究包括貨架效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性和運(yùn)輸穩(wěn)定性。 貨架效期穩(wěn)定性：選擇三批次試劑盒置于-20 ℃±5 ℃條件下保存，在效期的第 0、3、6、9、12、13 個月各進(jìn)行一次檢測，對試劑盒外觀、企業(yè)參考品及陰/陽性對照品檢測的結(jié)果顯示：試劑盒在生產(chǎn)后保存至13個月各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合產(chǎn)品技術(shù)要求，產(chǎn)品有效期可達(dá) 12 個月。 

此外，艾米森對產(chǎn)品的運(yùn)輸穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性等分別進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，產(chǎn)品的性能均滿足產(chǎn)品說明書的聲稱。