在進行藥物的有關物質檢查時，多采用高效液相色譜法，其計算方法有外標法、加校正因子的自身對照法、自身對照法及峰面積歸一化法。其中加校正因子的自身對照法定量準確，又無需在每次檢測時均提供雜質對照品，是目前較為常用的一種方法。小編在此對校正因子的測定以及校正因子準確度的驗證進行簡述。

一、校正因子的測定

校正因子的測定有單點法、多點法、標準曲線法及吸收系數比值法。已有多篇文獻報道過各方法的基本操作及優缺點，在此不再贅述。在進行校正因子測定時，小編建議采用標準曲線法，因為線性試驗是方法驗證必不可少的一項內容，在此采用標準曲線法，既驗證了雜質對照品及主成分的線性，又可得到準確的校正因子，可謂一舉兩得。

在進行校正因子的測定時，首先將各雜質對照品及主成分對照品配制成一定濃度的儲備液，逐步稀釋，直至找到各雜質的定量限，線性范圍應包括定量限濃度~限度濃度的150%，主成分的濃度范圍應包括定量限濃度~自身對照濃度的150%。例如，有關物質測定時，供試品的濃度為1mg/ml，采用0.1%的自身對照（即自身對照的濃度為1μg/ml），雜質A的限度為0.1%（即雜質A的限度濃度為1μg/ml），假設主成分及雜質A的定量限均為20ng/ml，則雜質A和主成分應在20ng/ml~1.5μg/ml的范圍將濃度與峰面積進行線性回歸，相關系數應大于0.990，Y軸截距應在100%響應值的25%以內。繪制出各雜質及主成分的線性曲線后，各雜質與主成分線性方程斜率的比值即為該雜質的校正因子。若雜質的校正因子在0.9~1.1的范圍內，無需驗證，直接采用自身對照法，若雜質的校正因子0.2~5.0之間，則需要采用加校正因子的自身對照法，若雜質的校正因子小于0.2或大于5.0，可考慮變換雜質的檢測波長，重新進行測定，若所有的測定均在0.2~5.0之外，則表示加校正因子的自身的對照法不適用，需要用外標法進行定量。

在配制各濃度的線性溶液時，一定注意需逐級稀釋，要避免出現下圖1所示的情況，應如圖2所示，保證個點分布的均勻性。

圖1  不正確的線性試驗設計

圖2 正確的線性試驗設計

二、相對校正因子及相對保留時間耐用性的考察

在采用加校正因子的自身對照法進行定量時，一般采用相對保留時間對雜質進行定位，在此，一并對相對校正因子及相對保留時間的耐用性進行考察。

具體考察方法同其他方法驗證的耐用性試驗，即變換波長、流速、柱溫、流動相比例、流動相pH值、采用不同品牌的色譜柱、儀器等。將各雜質對照品與主成分配制成混合對照品溶液，采用標準曲線法，繪制各條件下雜質對照品及主成分對照品的線性方程，計算校正因子，同時計算出各條件下雜質對照品相對于主成分的相對保留時間。

對相對校正因子，除波長的變化會對相對校正因子有所影響外，其余色譜條件的調整均不會對相對校正因子產生影響，因此，測定波長的選擇要避開吸光度急劇變化的位置，應選擇在最大吸收或最小吸收的位置。校正因子的變化范圍在多少范圍內可以接受，目前，沒有定論，小編認為，如果最終標準中相對校正因子只保留到小數點后一位，例如0.7，則各條件下校正因子均控制在0.65~0.74范圍內，即可判定耐用性較好。即采用有效數字的修約規則，修約后為標準中規定的數值即可。

對相對保留時間，除波長的變化對其沒有影響外，其余各條件的變化均會對其產生影響，為了保證對雜質的準確定位，必須對相對保留時間的耐用性進行考察。此處的試驗不是為了證明相對保留時間的耐用性良好，而是通過耐用性考察確定出如何采用相對保留時間對雜質進行定位。例如，固定色譜柱的填料及品牌，固定主峰的保留時間等。至于RRT在多少范圍內可以接受，不能一概而論，若雜質譜較復雜，則質量標準中的RRT需要保留至小數點后兩位，如果雜質譜相對簡單，各雜質距離較遠，RRT保留至小數點后一位即可。在此，跟大家分享另外一個經驗，即如果某些雜質的相對保留時間無法固定，隨色譜參數的變化較明顯，則可以采用將主成分進行定向破壞，通過系統適用性試驗來對雜質進行定位。

三、相對校正因子準確度的考察

配制相同的供試品溶液，同時采用加校正因子的自身對照法及外標法，對供試品中的雜質含量進行測定，對兩種方法的測定結果進行比較，校正因子與外標法計算結果的負偏差不得過0.05%，正偏差不做規定。若供試品中檢出的雜質較少，可在供試品中加入一定量的雜質對照品，來進行測定。

至此，可將相對校正因子固化到質量標準中，采用加校正因子的自身對照法對已知雜質進行定量計算，既保證了定量結果的準確，又簡化了試驗，節省了對照品的用量。