動物源性醫(yī)療器械病毒滅活/去除有效性驗證的原則

為了提高動物源性醫(yī)療器械的安全性，生產(chǎn)過程中需存在特定的滅活/去除病毒工藝步驟。為確認(rèn)這些工藝步驟對于滅活/去除病毒的有效性，需進(jìn)行相應(yīng)的驗證工作。

注：關(guān)于進(jìn)行滅活和去除病毒和/或傳染性因子工藝有效性驗證的驗證機(jī)構(gòu)的資質(zhì)要求需遵循相應(yīng)的法規(guī)。考慮到某些病毒可能會對從事驗證研究的人員造成健康危害，宜考慮采取適宜的保護(hù)措施。

對這些工藝的滅活/去除病毒有效性的驗證，需至少遵循以下原則：

一、驗證研究的設(shè)計

1.病毒滅活/去除有效性驗證研究通常是將已知量的指示用活病毒，加入到待驗證的工藝步驟處理前的模擬原材料或中間品中，然后定量測定經(jīng)工藝步驟處理后指示病毒數(shù)量下降的幅度，由此評價生產(chǎn)工藝的去除/滅活病毒效果。需合理設(shè)計與實(shí)際生產(chǎn)工藝相關(guān)的病毒去除/滅活研究試驗方案。一般只對可能或預(yù)期具有病毒去除/滅活效果的工藝步驟進(jìn)行驗證，不必對每個生產(chǎn)工藝步驟都進(jìn)行驗證。

為達(dá)到有效地去除/滅活效果，生產(chǎn)工藝中通常會聯(lián)合使用滅活與去除步驟，甚至多個從機(jī)制上能夠互補(bǔ)的去除和/或滅活步驟。如果產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝中包含了采用不同病毒去除/滅活方法（這里指不同機(jī)制的方法）的滅活/去除工藝步驟，需對這些步驟分別進(jìn)行病毒去除/滅活效果驗證。每一滅活/去除工藝步驟的病毒降低系數(shù)計算公式如下：

降低系數(shù)R = log₁₀ [（V₁×T₁）/（V₂×T₂）]

其中，V₁為步驟開始前材料的體積，V₂為步驟完成后的材料的體積，T₁為步驟開始前材料中的指示病毒滴度，T₂為步驟完成后材料中的指示病毒滴度。

注意：降低系數(shù)計算時要基于樣品中可檢測的指示病毒量，而不是基于所加入的指示病毒量。

2.為避免將任何病毒人為的引入實(shí)際生產(chǎn)設(shè)施，驗證工作應(yīng)在單獨(dú)的實(shí)驗室中進(jìn)行，因此通常采用縮小規(guī)模的生產(chǎn)工藝來模擬實(shí)際生產(chǎn)工藝。采用縮小規(guī)模生產(chǎn)工藝的方法，需盡可能模擬真實(shí)生產(chǎn)過程，按照能代表去除和/或滅活病毒能力最差情況的條件進(jìn)行設(shè)計。需分析生產(chǎn)工藝中各種參數(shù)的偏差對病毒去除/滅活效果的影響。

3.病毒滅活/去除的有效性同材料的結(jié)構(gòu)、尺寸和形狀以及病毒在材料中的分布有關(guān)，在研究設(shè)計中宜對此予以考慮。當(dāng)驗證樣品為固體材料時，需盡量模擬生物材料的病毒負(fù)載方式，使負(fù)載指示病毒充分而且均勻地浸入到材料的內(nèi)部。若此法不可行，則需盡可能采用對于去除/滅活效果更為不利的指示病毒負(fù)載方式。

4.要獲得對每個滅活/去除工藝步驟的準(zhǔn)確評價，必須保證每個步驟在起始時加入了足夠多的指示病毒負(fù)載量。然而，所加入的指示病毒懸液的體積不宜超過試驗樣品總體積的10%，以使試驗樣品在成分方面與生產(chǎn)材料保持相近。

5.如果可能，含有指示病毒的試驗樣品除所驗證的病毒滅活/去除步驟之外不宜再經(jīng)過進(jìn)一步的處理（如超速離心、透析）或儲存而直接進(jìn)行檢測。在進(jìn)一步處理或儲存無法避免時，宜采用適當(dāng)?shù)膶φ眨源_定這些處理和儲存過程對研究結(jié)果的影響。需詳細(xì)說明樣本制備及驗證試驗的過程并論證其合理性。

6.所采用的病毒定量檢測分析方法需具有充分的靈敏度和可重復(fù)性，需設(shè)計適宜的重復(fù)樣本試驗和對照，以確保結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義上足夠的精確性（同一檢測方法內(nèi)樣本組內(nèi)和組間差異的95%可信限宜達(dá)到±0.5log以內(nèi)，否則需對檢測結(jié)果的可信度進(jìn)行充分的論證）。需考慮研究材料中的某些特殊成分可能會對檢測的準(zhǔn)確度造成干擾，盡量設(shè)計采取相應(yīng)措施避免這些干擾。若無法避免，必要時需對干擾進(jìn)行定量評估。若采用感染性病毒檢測以外的其他方法進(jìn)行病毒測定，需提供充分的論證依據(jù)和理由。

7.滅活研究宜設(shè)計為在不同的時間點(diǎn)（包括零時）采樣，從而建立滅活動力學(xué)曲線。

8.在進(jìn)行去除研究時，如生產(chǎn)工藝中去除病毒的原理是通過將病毒分離為沉淀物或去除某些組分來降低病毒的感染性，則需對被除去的樣品也進(jìn)行研究。宜盡可能給出病毒在不同部分間的對比分布。

二、指示病毒的選擇

首先，需要選擇與實(shí)際生產(chǎn)用的動物源性材料中可能含有的病毒種類相關(guān)的指示病毒，不能用相關(guān)病毒的，要選擇與其理化性質(zhì)盡可能相似的指示病毒；第二，所選擇的指示病毒理化性質(zhì)需有代表性（病毒大小、核酸類型以及有無包膜），其中至少需包括一種對生產(chǎn)工藝所涉及的物理和/或化學(xué)處理有明顯抗性的病毒；第三，指示病毒初始滴度需要盡可能高（一般需≥10⁶/mL）。

表1列舉了已用于病毒滅活/去除研究的指示病毒。病毒的耐受性與特定的處理方式有關(guān)，只有在了解病毒生物特性和生產(chǎn)工藝特定情況下才能使用這些病毒，而且實(shí)際結(jié)果會隨著處理情況的變化而變化。

表1  已用于病毒滅活/去除研究的指示病毒舉例

三、效果的判定

對于病毒去除/滅活效果的判斷，應(yīng)考慮同時達(dá)到以下兩個要求：

（一）去除/滅活降低系數(shù)的要求

病毒去除/滅活有效性驗證的目的是為了確定生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒的能力，因此需獲得生產(chǎn)全過程中估計去除/滅活病毒的總降低系數(shù)。一般每種指示病毒的總降低系數(shù)為各步驟降低系數(shù)的總和。但是由于驗證方法的局限性，如分步驟中指示病毒降低系數(shù)≤1 log，則不宜將其計算在總量中。在分析試驗結(jié)果時需注意，如果將多步驟的去除/滅活病毒降低系數(shù)相加（特別是將去除/滅活效果不明顯的步驟相加）或者將工藝過程中重復(fù)采用的同樣或者類似去除/滅活機(jī)制形成的去除/滅活效果累加，可能會高估工藝實(shí)際能達(dá)到的效能。需考慮有效步驟對指示病毒的去除/滅活效果可能與實(shí)際生產(chǎn)工藝中使用的效果有一定偏差。

一般來說，醫(yī)療器械的生產(chǎn)過程中去除/滅活病毒的總降低系數(shù)宜達(dá)到6 logs以上（即病毒數(shù)量下降到進(jìn)行去除/滅活前數(shù)量的百萬分之一以下），并且原則上需至少有一個病毒去除/滅活步驟的降低系數(shù)達(dá)到4 logs以上（如因檢測方法的靈敏度造成檢測出的病毒降低系數(shù)接近但小于4 logs時，應(yīng)盲傳三代，如無病毒檢出，亦可認(rèn)為是有效地去除/滅活病毒步驟）。如果采用總降低系數(shù)達(dá)6 logs的病毒滅活/去除工藝將導(dǎo)致醫(yī)療器械產(chǎn)生不可接受的性能改變，則需要根據(jù)動物源性材料的來源、采集及處理過程控制情況以及對患者的風(fēng)險/受益分析來判斷其可接受性，但其單一去除/滅活病毒步驟的降低系數(shù)仍需達(dá)到4 logs以上。

即使驗證研究證明了去除/滅活病毒工藝的有效性，這僅說明動物源性材料中殘留病毒的感染性大幅度降低，但其數(shù)值永遠(yuǎn)不可能降至零。

（二）病毒滅活動力學(xué)要求

評價驗證結(jié)果不能僅考慮病毒降低量，同時也要考慮病毒滅活動力學(xué)。需以作圖的形式報告滅活動力學(xué)驗證結(jié)果。如果指示病毒殘留量很快降到最低檢出限度值，則說明此方法滅活病毒效果較好；如果指示病毒滅活速率緩慢，在滅活結(jié)束時才達(dá)到最低檢出限度值，則不能認(rèn)為是一個有效的病毒滅活方法。

四、關(guān)于朊蛋白

由于目前尚難以采用致病性朊蛋白（如傳染性海綿狀腦病因子）的指示因子對去除朊蛋白的工藝進(jìn)行驗證，因此對牛、羊源性材料制品的傳染性海綿狀腦病安全性還主要是對源頭進(jìn)行控制。基于目前對朊蛋白去除/滅活工藝驗證的認(rèn)知程度，對于牛、羊源性醫(yī)療器械，可以接受按照本附錄第一、二、三條闡述的原則所進(jìn)行的病毒去除/滅活有效性驗證。隨著對朊蛋白研究水平的不斷提高，相應(yīng)的要求也將隨時調(diào)整。