背景

近年來，全球生物制藥發展迅速，市場規模龐大，在2018年全球藥品銷售額Top 10中，生物大分子藥占據8個席位，包括單抗藥物6個，融合蛋白2個，分別為阿達木單抗Humria（修美樂）、帕博利珠單抗Keytruda（可瑞達，“K藥”）、曲妥珠單抗Herceptin（赫賽汀）、貝伐珠單抗Avastin（安維汀）、利妥昔單抗Rituxan（美羅華）、納武利尤單抗Opdivo（歐狄沃，“O藥”）和依那西普 (Etanercept)、阿柏西普 (Aflibercept)。

我國的生物制藥也在緊跟腳步。企業如此，國家更是如此。NMPA意識到規范藥品市場準入與藥品上市許可管理的重要性，近年陸續出臺了《生物制品注冊分類及申報資料要求(試行)》、《治療用生物制品注冊申報資料指南(試行)》，2020版《中國藥典》等，不斷更新完善生物藥品注冊申報的程序和資料，為企業研發提供規范且先進的指導。政策開先河，企業也要跟上步伐。目前，國內企業在在表征方法建立及數據解讀方面較弱，生物制藥分析表征和質量控制方面還有待加強。具體而言，國內生物藥企起步相對較晚，在生物制藥表征分析方法建立方面借鑒國外方法更多，還較少進行新方法建立。特別是對于創新藥的新特征，如何找到一種合適的表征方法，常常沒有頭緒。面對成分結構復雜的生物藥，如何從數據中找出樣品相關信息，判斷數據相關性和合規性，避免出現與預期不符的情況，是國內生物藥企需要提高的地方。

表征分類

人用藥物注冊技術要求國際協調會議ICH Q6B為生物技術產品的表征提供了一套統一的國際公認原則，以支持單抗藥物的市場應用。該文件建議進行分析以提供有關生物或生物制藥產品的以下信息：

生物藥表征分析：

氨基酸序列

氨基酸組成

末端氨基酸序列

肽圖

巰基和二硫鍵

糖基化結構

生物學活性等

工藝質量分析對于生物制藥的生產至關重要，并且貫穿整個流程。在前期階段，生物制藥研發過程中需要分析測試，在工藝開發與放大過程中，更需要質量控制把關。因此結構確證研究是生物制品注冊申報資料的必備要素，以生物類似藥為例，需全面對比多批次穩定中試工藝生產的原液和原研藥進行的結構分析，包括一級結構、高級結構、翻譯后修飾和輔料等。

序列及結構-色譜質譜技術

使用反相高效液相色譜（RP-HPLC）和柱前衍生化技術進行氨基酸組成分析，或者采用柱后衍生化處理的離子交換色譜法來確定生物制藥產品的氨基酸組成。

分子量

使用四極桿飛行時間質譜對完整和還原的mAb進行在線LC/ES-MS分析，徹底改變了以往完整分子量以及釋放的輕鏈和重鏈的測量方法。

氨基酸序列和多肽測定

以抗體藥為例，通過肽圖分析，氨基酸測序，質譜分析等方法從DNA序列中推導氨基酸序列，并確認DNA衍生序列。另外，N-末端氨基酸序列（是否存在游離氨基酸或焦谷氨酸）和C-末端氨基酸序列（例如，存在或不存在C-末端賴氨酸）的變異性，重鏈等）應進行分析。

圖1. LC/MS質譜技術

而蛋白序列分析，就是圍繞以質譜技術為主的分析方法。肽圖分析，使用特定蛋白消化酶，然后使用帶有紫外UV和電噴霧質譜檢測、可提供有關分子量的信息。為了分析mAb輕鏈和重鏈序列，將許多蛋白酶消化物與在線RP-HPLC和串聯MS/MS（LC/ES-MS/MS）分析聯合使用。N端測序，由于質譜的測序在大多數情況下無法區分異亮氨酸和亮氨酸（這些氨基酸具有相同的分子量），因此要明確分辨這兩個氨基酸，就需要對純化的肽在輕鏈和重鏈的可變區內進行自動N端測序。

末端氨基酸序列測定

進行末端氨基酸分析以鑒定mAb輕鏈和重鏈的氨基和羧基末端氨基酸序列。如果產品顯示一個以上的末端氨基酸序列，則應確定末端的相對量。使用Edman化學法進行自動化的N末端測序，在蛋白質的N末端具有游離的氨基官能團進行標記后，切割N末端和隨后的氨基酸。

巰基和二硫鍵測定

在肽圖分析測序分析中，還應把游離巰基和二硫鍵考慮在內。用特定蛋白酶消化后的肽圖分析，然后在還原前/還原后使用在線LC/ES-MS或LC/ES-MS/MS分析，可提供全面評估二硫鍵和游離基所需的mAb中的數據。

生物學活性-Biacore

在抗體體外生物學活行檢測項目中，抗體與抗原、Fcγ受體、FcRn以及Clq的親和檢測均需采用Biacore技術進行申報。在美國FDA批準上市的70多種抗體藥物中，80%都采用了Biacore技術完成了檢測和申報，Biacore也成為了中美日三國藥典收錄的互作分析技術。

藥效評價

抗體藥的藥效，不僅體現在Fab片段結合抗原的活性，還取決于其Fc片段，與Fcγ受體的相互作用，Fcγ受體的親和力能夠作為藥物功效及半衰期的預測指標。2013年 ，Roche針對 CD20靶點的單抗Gazyva獲批上市，用于慢性淋巴性白血病的治療。在申報材料中，Biacore技術用于Fcγ受體結合活性的測定 ， 結果顯示Gazyva比美羅華有更好的Fcγ RIII結合能力。

圖2. Biacore 技術檢測Inflectra和Remicade與 FcRn 的親和結果圖

一致性評價

一致性評價中關鍵一環是說明藥 物的生物活性和原研藥的相似性。在FDA生物類似藥指南中，Biacore技術是結合測定的首推方法。眾多企業在一致性評價中紛紛采用Biacore技術進行了申報上市，如Zarxio、Inflectra以及Benepali等。Biacore獨創性地開了指紋圖譜比對功能，利用其可以直接進行傳感圖細節比對并作出相似性打分，避免了由于擬合模型選擇等操作帶來的分析誤差，使結果更加直觀和準確。

圖3. Biacore平臺獨創性指紋圖譜比對技術

生物活性質量控制

抗體藥物由于分子量大 ，結構復雜，生物活性敏感，其工藝中每個環節的變化都可能導致產品質量出現差異。因此企業應 對抗體藥物工藝流程中的關鍵質量屬性（特別是生物活性） 進行實時監測、控制和放行。基于Biacore平臺可以建立全面的質控標準，完成結合活性、活性濃度、翻譯后修飾和雜質含量等的質量控制。Biacore平臺可以實時監控各工藝流程組分中抗體的生物活性，如細胞培養 、過濾 、 澄清等 ，活性有問題的抗體會出現解離加快、結合信號降低的現象 ，以幫助企業快速發現工藝中的問題。Biacore技術還可以用于最終產 品的批次放行，例如金賽藥業基于B iacore技術的生長激素蛋白批次放行標準獲得了中國食品藥品檢定研究院審批通過。

圖4. Biacore技術在藥物批次放行中的應用