導(dǎo)語(yǔ)

 

近年來(lái)，隨著細(xì)胞和基因治療等新技術(shù)的發(fā)展，耳科新藥的研究也開(kāi)啟了新的篇章。之前沒(méi)有治療方法的一些耳科疾病，現(xiàn)在也有了可以讓患者重新恢復(fù)聽(tīng)覺(jué)的方法和治療手段。這些新的治療方法的出現(xiàn)，也為非臨床研究提出了更高的要求和更新的評(píng)價(jià)方法。

 

首先，精準(zhǔn)的耳局部給藥是耳科藥物非臨床研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其次，聽(tīng)覺(jué)電生理檢測(cè)技術(shù)是非臨床研究中評(píng)價(jià)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)功能與病理機(jī)制的重要手段，其在基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化中具有不可替代的作用。聽(tīng)覺(jué)電生理技術(shù)結(jié)合精準(zhǔn)的耳局部給藥策略，為解析聽(tīng)覺(jué)疾病機(jī)制及開(kāi)發(fā)新型治療藥物提供了多維度的研究平臺(tái)。基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的聽(tīng)覺(jué)功能評(píng)估，結(jié)合聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位與畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射檢測(cè)技術(shù)，可精準(zhǔn)解析聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路的電生理特性。本文簡(jiǎn)要闡述在非臨床研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耳局部給藥技術(shù)、聽(tīng)覺(jué)電生理數(shù)據(jù)檢測(cè)方法及結(jié)果分析要點(diǎn)，為耳科疾病動(dòng)物模型構(gòu)建與耳科藥物研究提供參考。

 

耳部給藥技術(shù)

 

1.耳的解剖

耳的解剖結(jié)構(gòu)分為外耳、中耳和內(nèi)耳。外耳包括耳廓和外耳道。中耳介于外耳和內(nèi)耳之間，是位于顳骨中的不規(guī)則含氣腔和通道。包括鼓室、咽鼓管、鼓竇和乳突。中耳內(nèi)含聽(tīng)小骨，即錘骨、砧骨和鐙骨。內(nèi)耳又稱迷路，埋藏于顳骨巖部，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且精細(xì)，內(nèi)含聽(tīng)覺(jué)和前庭器官，按解剖和功能分為前庭、半規(guī)管和耳蝸3個(gè)部分。耳蝸位于鼓室內(nèi)壁的顳骨巖部，并嵌入顳骨巖部。與大鼠或犬相比，耳蝸在豚鼠中更明顯并更大程度向鼓室突出，在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中幾乎完全包含在顳骨內(nèi)。在豚鼠中表現(xiàn)為螺旋狀或“蜂巢狀”。內(nèi)耳按組織學(xué)可分為骨迷路和膜迷路，膜迷路內(nèi)有聽(tīng)覺(jué)與位覺(jué)感覺(jué)器。骨迷路和膜迷路之間充滿外淋巴液，而膜迷路中充滿內(nèi)淋巴液，內(nèi)、外淋巴液互不相通。    

 

人類與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耳部解剖差異主要體現(xiàn)在形態(tài)適應(yīng)性（如耳廓形狀）、功能特異性（如聽(tīng)力頻率范圍）和生理響應(yīng)（如耳毒性敏感性）等多個(gè)層面，但結(jié)構(gòu)組成大體一致。

 

 

2.耳部生物屏障

 

不同耳局部給藥途徑需要克服外耳道、鼓膜及中耳/內(nèi)耳的多重屏障，需根據(jù)病變部位（外耳、中耳或內(nèi)耳）和藥物性質(zhì)選擇適宜的給藥策略。

 

鼓膜（Tympanic Membrane, TM）

 

鼓膜為橢圓形半透明薄膜，分隔外耳道與鼓室。鼓膜略向中央凹陷，形似喇叭。鼓膜由外表皮層、內(nèi)粘膜層和含有膠原蛋白的中間纖維層等三層結(jié)構(gòu)組成。由于鼓膜具有角蛋白和富含脂質(zhì)的角質(zhì)層，因此除了相對(duì)較小和中等親脂性分子外，其他分子都無(wú)法透過(guò)鼓膜。

 

人及不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳部鼓膜結(jié)構(gòu)組成大致一致，但不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼓膜面積不同，在某些參數(shù)上如厚度、傾斜角度上也存在差異，在選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行研究時(shí)需要關(guān)注。

 

圓窗膜（Round Window Membrane, RWM）及卵圓窗（Oval Window）

 

RMW由三層結(jié)構(gòu)組成：包括面向中耳和耳蝸鼓階的上皮層和中間的結(jié)締組織層，將中耳和鼓階分開(kāi)，分子量小、脂溶性高和帶正電荷的藥物易于透過(guò)。卵圓窗由鐙骨足板封閉，它將前庭階與中耳隔開(kāi)。圓窗膜及卵圓窗阻礙了藥物遞送至耳蝸。

 

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類在圓窗膜和卵圓窗的解剖結(jié)構(gòu)和功能上存在一定差異，這些差異可能對(duì)聽(tīng)力研究、耳科手術(shù)或藥物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)產(chǎn)生影響。如想通過(guò)圓窗膜（RWM）內(nèi)耳給藥時(shí)必須考慮圓窗膜的空間立體結(jié)構(gòu)，這樣才能保證找到正確的角度以達(dá)到正確給藥的目的。

 

血-迷路屏障（Blood Labyrinth Barrier, BLB）

 

血-迷路屏障是體循環(huán)和耳蝸之間的理化屏障，與血腦屏障相似，該屏障將內(nèi)耳液體與血循環(huán)分開(kāi)。小分子且脂溶性良好的藥物相對(duì)容易通過(guò)血-迷路屏障，而帶電荷的、水溶性的或具有高分子量藥物一般較難通過(guò)血-迷路屏障。血-迷路屏障保護(hù)了耳部免受體循環(huán)中外源性和內(nèi)源性毒素的損害，但也因此使藥物從體循環(huán)遞送至耳蝸?zhàn)兊孟鄬?duì)困難。

 

基于以上，在選擇給藥方法時(shí)，不僅考慮藥物的性質(zhì)，也要考慮以上屏障對(duì)藥物的滲透和代謝的影響。

 

3.耳部給藥途徑

 

耳局部給藥需結(jié)合病變部位、藥物的理化性質(zhì)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖學(xué)特點(diǎn)選擇遞送路徑：

 

★外耳給藥

 

將藥物滴入外耳道，非入侵式給藥，但生物利用度較低。

 

★中耳給藥

 

鼓室注射（Intratympanic Injection）

 

操作步驟：

 

1.動(dòng)物側(cè)臥位固定，耳鏡直視下穿刺鼓膜后上象限（避免損傷聽(tīng)小骨）。

 

2.微量注射器緩慢注入藥物，留針一定時(shí)間防反流。

 

特點(diǎn)：鼓室給藥經(jīng)鼓膜穿刺，將藥物直接注入中耳。鼓膜穿刺孔可自行愈合，對(duì)聽(tīng)力的影響較小。另一方面，鼓室注射藥物在中耳停留時(shí)間短，藥物易通過(guò)咽鼓管流失。該給藥方式常用于急慢性中耳炎的局部藥物遞送。

 

★內(nèi)耳給藥

 

相比于外耳給藥和鼓室注射，耳蝸內(nèi)或者迷路內(nèi)給藥方法更能直接靶向內(nèi)耳，可提高生物利用度，且可以精確控制治療藥物的用量。

 

1.圓窗膜給藥（Round Window Membrane Delivery）

 

給藥方法：

 

顳骨開(kāi)窗，分離鼓室后壁軟組織，暴露圓窗龕。

 

顯微操作下將藥物通過(guò)圓窗膜緩慢注射入耳蝸。

 

特點(diǎn)：藥物直接經(jīng)外淋巴液擴(kuò)散至耳蝸，繞過(guò)血迷路屏障，生物利用度提高3-5倍，可減少系統(tǒng)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。適用于耳科基因治療藥物。

 

2.半規(guī)管給藥

 

在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，通過(guò)半規(guī)管骨壁開(kāi)窗，可以將藥物直接遞送至內(nèi)耳的外淋巴液和內(nèi)淋巴液。與圓窗注射相比，該給藥方式具有較小的手術(shù)損傷，可較好的保留聽(tīng)力功能。

 

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同的耳局部給藥方式。A，SD大鼠右耳鼓膜（圖源：昭衍新藥研究中心股份有限公司）。B，食蟹猴鼓室注射（圖源：昭衍新藥研究中心股份有限公司）C，食蟹猴內(nèi)耳圓窗膜給藥（圖源：昭衍新藥研究中心股份有限公司）。D，C57BL/6小鼠半規(guī)管給藥（圖源：昭衍新藥研究中心股份有限公司）。E，小鼠圓窗膜給藥（圖片引自Lin, Y. C., et al., Frontiers in Pharmacology, 2020）。

 

聽(tīng)覺(jué)電生理檢測(cè)

 

聽(tīng)覺(jué)電生理技術(shù)通過(guò)記錄聽(tīng)覺(jué)通路中不同層級(jí)的生物電信號(hào)，能夠定量、動(dòng)態(tài)地評(píng)估藥物對(duì)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的干預(yù)效果。該評(píng)估方法具有高靈敏度、實(shí)時(shí)性和非侵入性（或微創(chuàng)性）的特點(diǎn)，尤其適用于評(píng)估藥物對(duì)耳蝸毛細(xì)胞、聽(tīng)神經(jīng)及中樞聽(tīng)覺(jué)通路的特異性作用。

 

聽(tīng)覺(jué)電生理技術(shù)通過(guò)記錄聽(tīng)覺(jué)通路中神經(jīng)元電活動(dòng)的時(shí)空特征，評(píng)估外耳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能完整性。聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)路徑如下：外耳（聲波收集）→中耳（機(jī)械傳導(dǎo)）→內(nèi)耳耳蝸（毛細(xì)胞換能）→聽(tīng)神經(jīng)（動(dòng)作電位傳遞）→腦干（神經(jīng)核團(tuán)整合）→皮層（聽(tīng)覺(jué)感知）。

 

聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路

 

1.檢測(cè)技術(shù)

 

聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)（Auditory Brainstem Response，ABR）作為聽(tīng)覺(jué)通路的“全局監(jiān)控”：通過(guò)頭皮電極記錄聲音刺激誘發(fā)的腦干神經(jīng)電活動(dòng)，反映從聽(tīng)神經(jīng)到腦干的聽(tīng)覺(jué)通路功能；如藥物可能損傷聽(tīng)神經(jīng)（如化療藥）或者中樞聽(tīng)覺(jué)處理系統(tǒng)（如具有神經(jīng)毒性藥物）時(shí)，進(jìn)行ABR檢測(cè)可以全面監(jiān)控聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路?；儺a(chǎn)物耳聲發(fā)射（Distortion Product Otoacoustic Emissions，DPOAE）作為耳蝸健康的“靈敏探針”：通過(guò)檢測(cè)耳蝸外毛細(xì)胞對(duì)雙音刺激產(chǎn)生的非線性畸變聲信號(hào)，可反映耳蝸主動(dòng)放大功能的健康狀況；其能在耳毒性藥物損傷作用前期，檢測(cè)到外毛細(xì)胞功能異常，顯著早于ABR或者組織學(xué)發(fā)現(xiàn)。進(jìn)行藥物非臨床評(píng)價(jià)時(shí)將二者聯(lián)合應(yīng)用，可用于判斷聽(tīng)覺(jué)損傷部位。例如若ABR異常而DPOAE正常，提示損傷位于耳蝸后（如聽(tīng)神經(jīng)）；若兩者均異常，則耳蝸為原發(fā)損傷靶點(diǎn)。

 

ABR：通過(guò)短聲（click）或短純音（tone burst）刺激，記錄腦干神經(jīng)核團(tuán)的誘發(fā)電位，分析各波的潛伏期與振幅，評(píng)估聽(tīng)閾及神經(jīng)通路完整性（如聽(tīng)神經(jīng)瘤定位）。在常用試驗(yàn)動(dòng)物中，嚙齒類動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)功能報(bào)導(dǎo)較多，學(xué)者們已經(jīng)研究了十余種品系小鼠的聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)，報(bào)導(dǎo)了常見(jiàn)動(dòng)物BALB/cJ、C57BL/6J小鼠等的正常聽(tīng)覺(jué)閾值數(shù)據(jù)。

 

DPOAE：基于耳蝸外毛細(xì)胞非線性響應(yīng)特性，檢測(cè)2f1-f2畸變產(chǎn)物的聲發(fā)射信號(hào)，定量評(píng)估耳蝸功能。耳蝸受一定頻率比關(guān)系（f2/f1=1.2）的純音f1、f2作用，兩者相差20%。

 

輔助技術(shù)：耳蝸微音器電位（Cochlear Microphonic, CM）用于驗(yàn)證毛細(xì)胞活性；事件相關(guān)電位（Event-Related Potentials, ERP）解析高級(jí)聽(tīng)覺(jué)認(rèn)知功能。

 

 

2.數(shù)據(jù)采集標(biāo)準(zhǔn)化流程

 

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與動(dòng)物管理

 

麻醉：使用合適的麻醉劑，維持麻醉深度以及呼吸頻率穩(wěn)定。

 

頭部固定：使動(dòng)物頭部固定，確保耳道軸線與聲刺激源對(duì)齊，避免耳道扭曲或鼓膜遮擋，防止聲波傳遞失真。

 

信號(hào)采集

 

檢測(cè)系統(tǒng)：TDT RZ6生物信號(hào)處理器。

 

電極定位和選擇：選擇合適的耳聲發(fā)射探頭并設(shè)置電極阻抗，以提高信噪比。阻抗過(guò)高可導(dǎo)致信號(hào)衰減，過(guò)低易引入噪聲。

 

刺激類型：Click聲（0.1ms脈寬）；短純音（tone burst，上升/下降時(shí)間1ms，平臺(tái)2ms）。

 

數(shù)據(jù)記錄與質(zhì)量控制

 

信號(hào)疊加：選擇合適的信號(hào)疊加次數(shù)，以提升信噪比。

 

噪聲控制：屏蔽室環(huán)境噪聲＜30dB SPL。

 

3.數(shù)據(jù)分析

 

 ABR波形結(jié)果分析

 

聽(tīng)閾：聽(tīng)閾為引出ABR波形所需的最小聲音強(qiáng)度，也是聽(tīng)力敏感性的客觀測(cè)量指標(biāo)。以SD大鼠click ABR結(jié)果為例，從高到低的音量刺激（90dB至35dB），波峰（波Ⅰ至波Ⅴ）振幅逐漸降低、峰時(shí)逐漸延后。在刺激強(qiáng)度為40dB的刺激音下，ABR波形無(wú)延續(xù)性，且無(wú)明顯波峰；而在強(qiáng)度為45dB的刺激音下可觀察到相對(duì)明顯波峰Ⅱ，則該次檢測(cè)聽(tīng)覺(jué)閾值可判定為45dB。

 

此外，除分析聽(tīng)覺(jué)閾值外，還可以分析以下指標(biāo)：

 

潛伏期：聲刺激開(kāi)始與相應(yīng)ABR峰值出現(xiàn)之間的時(shí)間間隔，提示了有關(guān)沿聽(tīng)覺(jué)通路的神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

 

振幅：ABR峰值的大小，反映了聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元同步放電的數(shù)量，提示聽(tīng)覺(jué)通路的完整性。

 

波形：ABR通常在刺激后的10ms內(nèi)相繼出現(xiàn)5到7個(gè)正向波，可以揭示有關(guān)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的功能組織和聽(tīng)力損失的類型。普遍認(rèn)為，波I至波V分別與聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)、耳蝸核、上橄欖復(fù)合體、外側(cè)丘系和下丘的神經(jīng)元活動(dòng)有關(guān)。以SD大鼠為例，可以明顯觀察到5個(gè)正向波，且波Ⅱ振幅最大，波Ⅲ振幅最小，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

 

DPOAE數(shù)據(jù)分析

 

閾值判讀：取DP值前后分別相鄰兩個(gè)值，共四個(gè)點(diǎn)并取平均值。當(dāng)DP值減去平均值所得結(jié)果≥9，表示在該強(qiáng)度分貝下受檢動(dòng)物聽(tīng)力正常。在所有通過(guò)的DP值中，若所在的分貝值最小，則該分貝值為最小聽(tīng)覺(jué)閾值。

 

反應(yīng)幅值：分析不同頻率的反應(yīng)幅值，對(duì)耳蝸功能進(jìn)行評(píng)估。

 

不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的組織病理學(xué)檢查

 

在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種中，耳可分為三個(gè)區(qū)室。外耳包括耳郭和外耳道。鼓膜是外耳道和中耳之間的屏障。中耳由鼓膜形成的鼓室組成，內(nèi)含錘骨、砧骨和鐙骨三個(gè)聽(tīng)小骨。內(nèi)耳由耳蝸（參與聽(tīng)覺(jué)）和前庭裝置（平衡）組成。前庭器包括半規(guī)管、橢圓囊和小囊的骨迷路和膜迷路。橢圓囊和球囊是耳石器官。

 

根據(jù)給藥方式的不同，對(duì)耳的組織病理學(xué)檢查側(cè)重點(diǎn)不同，如通過(guò)鼓膜中耳給藥時(shí)，解剖摘取時(shí)要保證整個(gè)耳的完整，脫鈣后取材時(shí)的方向要保證中耳腔的最大面，切片中要可見(jiàn)鼓膜、部分聽(tīng)小骨、以及內(nèi)耳的corti器。如通過(guò)內(nèi)耳圓窗給藥時(shí)，解剖摘取時(shí)要保證不能破壞嵌入顳骨中的耳蝸，取材時(shí)要切到耳蝸的最大螺旋面。解剖時(shí)的精細(xì)摘取，固定和取材時(shí)的正確處理，以及制片中的重點(diǎn)關(guān)注是評(píng)價(jià)聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的基礎(chǔ)。

 

 

 

(昭衍新藥視聽(tīng)平臺(tái)/文 ) 

 

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