本文的目的是為了探討注射用甲苯磺酸奧馬環素的無菌方法開發及驗證。通過采用薄膜過濾法，使用1mol·L-1硫酸鎂溶液對樣品及所用培養基進行處理，pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含 0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）進行沖洗，有效地消除了樣品的抑菌性。得出的結論為采用 1 mol·L-1 硫酸鎂溶液及 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含 0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）可以有效地消除注射用甲苯磺酸奧馬環素的抑菌性能，可以將該方法用于注射用甲苯磺酸奧馬環素的無菌方法驗證。

 

注射用甲苯磺酸奧馬環素的主要成分是甲苯磺酸奧馬環素。甲苯磺酸奧瑪環素是一種新型的廣譜抗生素，屬于環素類抗生素家族。它通過抑制細菌蛋白質的合成來發揮抗菌作用。甲苯磺酸奧瑪環素的結構穩定，不易被細菌產生的酶類破壞，因此能夠有效應對一些對常規抗生素產生耐藥性的細菌。甲苯磺酸奧瑪環素的抗菌活性廣泛且強大，尤其是對多重耐藥菌的抑制作用顯著。它對多種常見的致病菌，如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等，均顯示出良好的抗菌效果。此外，甲苯磺酸奧瑪環素還能夠有效應對一些對其他抗生素產生耐藥性的細菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等。

 

甲苯磺酸奧馬環素是一種有機化合物，分子式為 C29H40N4O7 · C7H8O3S，是一種醫藥原料藥，是白色至黃色的固體，能溶于二甲基亞砜。

 

中國藥典 四部 1105 表2 常見干擾物的中和劑或滅活方法中喹諾酮類抗生素可選用的中和劑為鎂或鈣離子[1]。王靜[2]等人在抗生素類藥品無菌檢查方法的研究進展中就薄膜過濾法中的沖洗選用了卵磷脂和吐溫、 二價金屬離子（如鎂離子、鈣離子和錳離子等）作為中和劑中和抗生素類藥品的抑菌性。鄒曉平[3]等人在頭孢西丁鈉無菌檢查消除抑菌性的研究中加入 β- 內酰胺酶來消除頭孢西丁鈉的抑菌活性。劉健[4] 等人在無菌檢查時消除美羅培南的抑菌性一文中采用加大人工振蕩和增加沖洗次數的薄膜過濾法消除美羅培南的抑菌性。王君[5]等人在 β- 環糊精溶液在注射用德拉沙星無菌檢查中的應用中聯合使用了β- 環糊精溶液和無菌氯化鎂溶液，消除德拉沙星的抑菌作用。

 

1、消除抑菌活性的方法

消除供試品的抑菌活性是無菌測試方法驗證中的難點。供試液接種后，按規定的方法進行培養。與對照管比較，如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，需要采用適宜的方法消除供試品的抑菌活性。對于具有抑菌活性的供試品，為了消除供試品的抑菌性應盡量選擇操作簡便、快速的方法，同時所選用的方法應避免損傷供試品中污染的微生物。對于抑菌活性比較強的供試品，在供試品溶液性狀允許的情況下，應盡量選用薄膜過濾法[1]。

 

無菌檢查中消除抑菌活性的方法有：稀釋法、薄膜過濾法、加入適宜的中和劑或滅活劑，對于抑菌性強的供試品，可聯合使用上述方法去除抗菌活性。

 

2、試驗程序

文中所用培養基參照 2020 年版1101 無菌檢查中關于培養基的要求進行無菌性和靈敏度檢查，結果均符合規定。所用菌株均為采購的 3 代商業定量菌株。

 

2.1樣品信息（見表1）

表1 樣品信息

 

2.2試驗儀器和材料

 

（見表2、表3、表4及表5）

 

 

表2 試驗中的儀器設備

表3 試驗中的耗材

表4 試驗中的培養基和試劑

表5 試驗中的菌株

 

2.3方法開發試驗

 

按照《中國藥典》2020 年版，該樣品的批產量大于 500 瓶，每瓶的裝 100 mg。按《中國藥典》2020 年版四部通則 1101 無菌檢查法，供試品接種每種培養基的最少檢驗數量為 20 瓶，每瓶供試品接入每種培養基的最少檢驗量為 50 mg。

 

由于注射用甲苯磺酸奧馬環素的抑菌性較強，為了節約樣品，使用 1 支樣品進行小試，小試成功后再進行放大試驗。

 

2.3.1 預試驗一

 

2.3.1.1. 取 1 支樣品，用 3 mL（含0.1% 吐溫 80）的 0.1% 無菌蛋白胨水溶液溶解，轉移至（含 0.1% 吐溫 80）的 0.1% 無菌蛋白胨水溶液至 100 mL。

 

2.3.1.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用500 mL（含0.1%吐溫80）的0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 100 mL。在最后一次使用的沖洗液中加入不大于 100 cfu 的金黃色葡萄球菌，進行過濾。過濾結束后，泵入100 mL 的硫乙醇酸鹽流體培養基。

 

2.3.1.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.1.2.。

 

2.3.1.4. 試驗結果：試驗組無菌生長，菌液組生長良好。

 

2.3.2 預試驗二

 

2.3.2.1. 取 1 支樣品，用 3 mL 無菌水復溶，加入一支 Ca(OH)2 緩沖液，混勻，轉移至 100 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液中，制得供試液。

 

2.3.2.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用 300 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為100 mL。在最后一次沖洗液中加入不大于 100 cfu 的金黃色葡萄球菌，過濾。過濾結束后，泵入 100 mL 的硫乙醇酸鹽流體培養基。

 

2.3.2.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.2.2。

 

2.3.2.4. 試驗結果：試驗組較菌液組生長緩慢，第 3 天時長勢接近。證明Ca(OH)2 對消除樣品中的抑菌性有一定的作用。

 

2.3.3 預試驗三

 

2.3.3.1. 取 2 支樣品，一支用 0.6 mL的（含 0.1 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3%吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解，一支用 3 mL 的（含 0.1 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解，混勻，過濾。

 

2.3.3.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用 900 mL（含 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 100 mL。在最后一次使用的沖洗液中加入不大于 100 cfu 的金黃色葡萄球菌，進行過濾。過濾結束后，泵入 100 mL 的硫乙醇酸鹽流體培養基。

 

2.3.3.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.2.2。

 

2.3.3.4. 試驗結果：與菌液對照組相比，試驗組生長緩慢，在第 3 天時長勢接近菌液組。結果觀察中發現用 3 mL溶解液復溶樣品的試驗組較用 0.6 mL溶解液復溶樣品的試驗組生長更好。證明緩沖液中所加的 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80 對消除樣品中的抑菌性有一定的作用。

 

2.3.4 預試驗四

 

考慮到 Ca(OH)2 和 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80 對消除樣品的抑菌性都具有一定的作用，但分別使用時效果不明顯，以上兩種方式聯合使用。

 

2.3.4.1. 取1支樣品，pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解，加入一支Ca(OH)2 緩沖液，混勻，制得供試液。

 

2.3.4.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用 900 mL（含 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 100 mL。在最后一次使用的沖洗液中加入不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌。

 

2.3.4.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.4.2。

 

2.3.4.4. 試驗結果：與菌液對照組相比較，試驗組生長良好。

 

2.3.5 預試驗五：放大開發

 

2.3.5.1. 取 10 支樣品，每支用 5 mL飽和的 Ca(OH)2 水溶液溶解，混勻，振蕩，合并溶解液至 100 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液中，制得供試液。

 

2.3.5.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用 500 mL（含 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 100 mL。在最后一次使用的沖洗液中加入不大于 100 cfu 的金黃色葡萄葡萄球菌。

 

2.3.5.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.5.2。

 

2.3.5.4. 試驗結果：與菌液對照組相比較，試驗組雖有菌生長，但生長緩慢且微弱。

 

2.3.6 預試驗六

 

考慮到飽和的 Ca(OH)2 在 0℃時的溶解度是 0.18 g，溶解度較小，更換為硫酸鎂溶液繼續放大開發。

 

2.3.6.1. 取 10 支樣品，每支用 5 mL1 mol · L-1 的 MgSO4 水溶液溶解，混勻，振蕩，合并溶解液至 100 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液中，制得供試液。

 

2.3.6.2. 先用適量的沖洗液沖洗集菌器濾膜，使濾膜潤濕。將上述樣品溶液過濾。用 500 mL（含 0.1 組氨酸、0.3%卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗液用量為 100 mL。在最后一次使用的沖洗液中加入不大于 100 cfu 的金黃色葡萄葡萄球菌。

 

2.3.6.3. 用緩沖液代替供試品，操作同 2.3.6.2。

 

2.3.6.4. 試驗結果：與菌液對照組相比，試驗組生長良好。

 

2.3.7 結論

 

通過以上6組預實驗，證明用1 mol · L-1 的 MgSO4 與（含 0.1 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，以上兩者聯用，可以消除注射用甲苯奧馬環素的抑菌性。為了使樣品中 1 mol · L-1 的MgSO4 的含量更多，試驗組能更好的生長且對微生物無毒，在不改變 MgSO4 濃度條件下，對硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基進行預處理。

 

3、驗證步驟

 

3.1供試液制備

 

取20瓶注射用甲苯磺酸奧馬環素（規格為100mg/ 瓶）， 每瓶加入5mL 1mol·L-1 硫酸鎂溶液，振蕩數次，供試品完全溶解后，每瓶取 2.5 mL，合并至 100 mL pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含 0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）中，制得供試品溶液。共制備 6 份。

 

3.2培養基預處理

 

每 100 mL FTM 培養基中加入10 mL 1 mol · L-1 硫酸鎂溶液，共制備 7份；每 100 mL TSB 培養基中加入 10 mL1 mol · L-1 硫酸鎂溶液，共制備 7 份，振蕩數次，混勻待用。

 

3.3試驗組

 

3.3.1. 取少量 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含 0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）過濾以潤濕濾膜。

3.3.2. 將制備好的供試品溶液過濾，再用pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（含0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫80）沖洗，分 5 次，每次 100 mL。在最后一次的沖洗液中加入 0.1 mL 的102 ～ 103 cfu/mL 金黃色葡萄球菌（不大于 100 cfu），過濾。同法，試驗菌換成大腸埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉，過濾。

 

3.3.3. 過濾完成后，加培養基至濾筒內，接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和生孢梭菌的濾筒內加入 100 mLFTM，接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的濾筒內加入 100 mL TSB。

 

3.4陽性對照組

 

用緩沖液代替供試液，操作同3.3.1-3.3.3。

 

3.5陰性對照組

 

3.5.1. 取少量 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含 0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）過濾以潤濕濾膜。

3.5.2. 用緩沖液代替供試液過濾，再用 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液（含0.1% 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫80）沖洗，分 5 次，每次 100 mL。同法共制備 2 支無菌檢測筒。

 

3.6培養

 

將胰酪大豆胨液體培養基和硫乙醇酸鹽流體培養基，置規定溫度培養，培養時間不得超過 5 天。

 

3.7菌液計數

 

分別注入 0.1 mL 的 102 ～ 103 cfu/mL 試驗菌到培養基表面并用涂布棒涂布均勻（每種試驗菌平行制備 2 個計數平板）。

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌和生孢梭菌計數 TSA 于30 ～ 35℃培養不超過 3 天；白色念珠菌和黑曲霉計數 TSA 于 30 ～ 35℃培養不超過 5 天。

 

生孢梭菌使用厭氧產氣袋和厭氧指示劑置于培養箱中厭氧培養，其他試驗菌在培養箱中需氧培養。

 

3.8結果觀察

 

觀察培養結果，若澄清則無菌生長；若渾濁，需要記錄生長情況：生長良好或者生長微弱、緩慢或不生長。

 

4、驗證結果

注射用甲苯磺酸奧馬環素的無菌檢查方法學驗證，采用薄膜過濾法，對1 批次注射用甲苯磺酸奧馬環素進行 3次獨立無菌驗證，檢驗量為半量。3 次試驗結果均為陰性對照組無菌生長；陽性對照組各試驗菌生長良好；與陽性對照組比較，試驗組各試驗菌生長良好；各試驗菌菌液計數平均菌落數均不大于100 cfu/ 皿，符合要求。無菌檢查方法適用性試驗結果詳見表 6、表 7、表 8。

 

表6 第一次無菌檢查方法適用性試驗結果

表7 第二次無菌檢查方法適用性試驗結果

表8 第三次無菌檢查方法適用性試驗結果

 

5、結 論

使用 1 mol · L-1 的 MgSO4 溶解樣品，薄膜過濾后，再用 500 mL（含 0.1 組氨酸、0.3% 卵磷脂和 3% 吐溫 80）的 pH 7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，在泵入的100 mL FTM 和 TSB 中各加入 10 mL 的1 mol · L-1 的 MgSO4 混勻，此方法可以有效地消除注射用甲苯奧馬環素的抑菌性并用于注射用甲苯奧馬環素的無菌驗證。

 

參考文獻

 

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[2] 王靜，王振波，戴翚，肖璜，王似錦，周發友，馬仕洪 . 抗生素類藥品無菌檢查方法研究進展. 中國抗生素雜志，2024.

[3] 鄒曉平，張東霞 . 頭孢西丁鈉無菌檢查消除抑菌性的研究. 中國科技縱橫，2011.

[4] 劉健，楊翠竹，韓峰，任璐，李更田.無菌檢查時消除美羅培南的抑菌性.中國保健營養（中旬刊），2013.

[5] 王君，吳俊紅，黃加秀，等 .β環糊精溶液在注射用德拉沙星無菌檢查中的應用 [J]. 中國藥品標準.2022.

 

本文作者印萍，江蘇艾蘇萊生物科技有限公司，僅供交流學習。