老人和兒童是兩群最敏感且需要重點關注和保護的群體。目前尚沒有針對老年人群的特定指導原則，但針對兒童和青少年藥物的非臨床評價指導原則，FDA、EMA和ICH等均有發布。2009年，美國46%的藥物標簽顯示可用于兒童。然而，兒童并不是小號的成年人，基于成年人數據上市的藥物給予兒童標簽外用藥是有重大安全性風險的。兒童在解剖、生理、發育方面的差異導致對于藥物代謝、腎臟清除、藥物-藥物相互作用及毒性敏感度等方面與成人可能是不同的。很多藥物在幼齡人群和成年人中的毒性表現也是有區別的，比如氯霉素由于在幼齡人群中的半衰期和暴露量增加，會增加新生兒的死亡率。又如吸入型糖皮質激素會影響兒童的生長速度。因此，對于臨床擬用人群有未成年人的情況，需要在幼齡動物中開展非臨床風險評估。
幼齡動物毒性評價最核心的關注點是出生后重要器官的發育毒性。比如大腦神經發育會持續整個青春期（Adolescence），腎臟功能和胃腸道系統功能在1歲左右才達到成人水平，肺泡成熟通常在2歲左右，免疫球蛋白IgG和IgA在5-12歲時達到成年人水平，生殖系統在青春期才完全成熟，骨骼系統更是要到25-30歲發育結束。因此，根據藥物的用藥人群年齡不同，可能影響的器官發育、功能也會有所區別。
而幼齡動物研究結果在臨床兒童轉化方面是具有重要價值的。比如通過研究發育中的嚙齒動物神經系統，發現了苯巴比妥對兒童認知能力的影響。通過研究六氯苯酚對發育中大鼠和猴的神經毒性，成功提示了臨床新生兒的對應風險。動物試驗發現未發育成熟心臟對鈣離子阻斷劑更為敏感，這一結論對維拉帕米引起嬰兒心血管并發癥發生率增加有重要提示價值。茶堿在幼齡動物中發現的驚厥副作用，也在臨床幼年人群中得以驗證。
幼齡動物非臨床研究已經有一系列指南和電子刊物發布，羅列如下：
1）FDA，2006，Guidance for Industry: Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products.
2）EMA，2008，Guideline on the Need for Nonclinical Testing in Juvenile Animals on Human Pharmaceuticals for Pediatric Indications.
3）JMHLW，2012，Guideline on Nonclinical Safety Studies in Juvenile Animals for Pediatric Drug Development.
4）ICH S11，2020，NONCLINICAL SAFETY TESTING IN SUPPORT OF DEVELOPMENT OF PAEDIATRIC PHARMACEUTICALS.
5）NMPA，2017，兒科用藥非臨床安全性研究技術指導原則（征求意見稿）。
6）黃芳華，王慶利等，2017，《幼齡動物毒理學研究: 試驗設計、實施和結果分析》。
7）單曉蕾，黃芳華等，2022，《幼齡動物毒理學試驗的案例分析及考慮要點》。
當然ICH M3、ICH S6、ICH S9等指南對于符合特定產品分類、適應癥或通用要求的也是可以參照的。
那么什么情況下需要開展幼齡動物毒理研究呢？
籠統的講，當現有的臨床數據、非臨床數據不能支持藥物在兒童患者中的安全性時，幼齡動物的非臨床研究就有了必要性。比如：1）同類型產品（包括同靶點、同作用機制、相似機制等）如果已經有針對幼齡動物毒性的擔憂；2）本品的臨床研究已有充分數據提示潛在的風險；3）非臨床成年動物研究數據顯示出發育毒性風險，或者提示有某些方面的特別擔憂，需開展進一步研究，如毒性的可逆性、充分的安全窗口探索等；4）現有臨床、非臨床安全性數據對于擬用于兒童的支持是不充分的。對于大部分藥物，在用于兒童之前，其實已經有了成年人的安全性和有效性數據，甚至有些已經有12歲以上未成年患者的數據。可以結合已有的臨床前和臨床數據，科學合理設計幼齡動物的研究方案。ICH S11對于是否需要額外開展幼齡動物非臨床安評，建議進行證據權重分析，其中最重要的考量因素是臨床擬用患者的最小年齡以及對發育中器官系統是否有可疑影響，其它考量因素還包括前期資料完整度、藥物靶點對器官發育的作用、藥物的選擇性和特異性等，如下圖所示。ICH S11附錄中關于證據權重分析決定幼齡動物非臨床安評是否需要開展給出了多個案例，可以參考。
對于先用于兒科或兒科專用藥物，如果可能，建議先進行成年健康志愿者試驗。再根據成年動物非臨床數據、成年健康人體數據等進行證據權重分析。對于無法實現成年健康志愿者給藥，也無成年動物數據支持的情況，就需要開展比較全面的幼齡動物非臨床研究，包括幼齡嚙齒和幼齡非嚙齒類動物一般毒理、安全藥理學、遺傳毒性等。
研究設計和考量
幼齡動物毒理研究多以嚙齒類為主，先從整體看下一項嚙齒類幼齡動物毒理試驗，如下圖所示。除了常規體重、攝食量、臨床病理、組織病理學檢查、眼科檢查外，需要特別關注骨骼、神經系統、生殖系統、心血管系統等發育情況。另外，可以考慮將功能觀察組合測試（functional observation battery, FOB）嵌入一般毒性試驗中。
種屬選擇方面，選擇依據與成年動物類似。如果前期已經完成成年動物毒理研究，且已經有成年人體數據，FDA、EMA、ICH均認為采用一種最相關種屬開展幼齡動物毒理研究即可。來自10家藥企的39個幼齡動物毒理數據顯示，大鼠是最常用種屬。但是，如果擬開發產品是兒科專用或先是兒科的適應癥，這種情況下沒有前期成年動物、臨床數據支持，通常需要在兩個種屬（嚙齒+非嚙齒）幼齡動物中開展研究，感興趣的可翻閱下脊髓性肌萎縮癥治療藥物諾西那生鈉（nusinersen，商品名Spinraza）的相關資料。大鼠作為最常用種屬，優點是比較經典，歷史對照資料豐富，發育時間短，可進行大量發育重點指標的考察，易于操作等。當然，大鼠也有其局限性，具體優、缺點如下表所示。
對于生物制品，如果大鼠不是相關種屬怎么辦？用非人靈長類（non-human primate，NHP）開展幼年動物毒理研究嗎？NHP開展幼齡動物毒理研究非常具有挑戰性，離乳前用藥涉及繁殖、運輸和母體/嬰仔對的處理，離乳后（大約6個月齡）器官系統的成熟度通常已超過許多兒科相關年齡。如果有成年動物發育和生殖毒理學試驗數據，主要是圍產期發育毒性試驗，可能足以支持兒科研究的非臨床風險。如果沒有，可以考慮采用轉基因動物、替代分子或者其它體外試驗系統等方案解決。
研究用動物所屬年齡段與臨床擬暴露人群的年齡應該具有可比性，給藥起始年齡應與臨床擬用最小年齡相當。下圖是不同種屬動物和人體年齡對比示例圖。
幼齡動物一般不太建議從出生當天就開始給藥，有可能會影響動物的存活率。根據給藥途徑不同，種屬不同，允許最早起始給藥時間如下表所示。
對需離乳前給藥的，一般持續1-3個月。對于幼齡大鼠，PND2-4，PND7和PND21開始給藥，可以分別支持新生兒、1個月的嬰兒和2歲兒童的臨床試驗。給藥結束時動物的年齡應該是睪丸真正的成熟后（約PND59-63），或者至少覆蓋了發育的關鍵窗口期。這也是為什么大鼠使用最多的一個原因，從開始發育到性成熟的周期短。犬和小型豬的發育窗口期比大鼠長很多，非人靈長類就更不實用了。給藥起始年齡不合適是審評中的常見問題，需要特別關注。
劑量選擇方面，FDA建議探索出清晰的劑量-效應關系。高劑量應產生可識別的毒性，如發育毒性或一般毒性。中劑量最好也產生一定程度的毒性反應。低劑量則產生輕微毒性或不產生毒性，如果可能，最好是NOAEL劑量。幼齡動物毒性可能比成年動物更為敏感，也可能更不敏感，簡單從成年動物數據推導幼齡動物并不合理，建議在開展幼齡動物正式毒理研究之前，先開展預試驗進行劑量探索。另外，要避免毒性劑量水平過高導致生長發育遲緩而引起器官系統的繼發性影響和/或母體忽略/拒絕哺乳幼仔。對體重產生明顯影響可能會混淆終點判斷。
給藥途經方面，給藥途經要求與成年動物研究類似，與臨床擬用途徑保持一致。如果無法實現，需要說明采用替代途徑給藥的原因及合理性。兒童最常見的給藥途徑是口服，且因吞咽膠囊或片劑的難度，液體制劑的設計更為合理。嚙齒類動物口服給藥，通常最早開始給藥的時間是出生后第4或7天（PND4或PND7）。如果計劃出生后就開始用藥，推薦腹腔或皮下注射。年齡特別小的動物，靜脈注射給藥難度很大，不是所有實驗室均能熟練操作。另外，給藥體積也需要特別注意，對于嚙齒類動物，不同的給藥途徑，其給藥體積或適用年齡如下: 1）口服：5 mL/kg，超過此給藥容量會影響攝食；2）皮下給藥：3-5 mL/kg，適合于PND 4 或更大年齡動物。開始時一般3個注射部位（肩胛、腰椎左右）給藥，在成長過程中，最多可對5個部位給藥；3）靜脈注射：靜脈推注為5mL/kg，小于PND18 不能重復靜脈注射給藥；4）吸入給藥：離乳前采用全身暴露的方式，無法吸入給藥；鼻腔給藥僅可在離乳后；5）經皮給藥: 僅在離乳后可行。
TK采血方面，細胞色素P450酶、藥物轉運體和激素隨著發育而變化，造成藥物在吸收、分布、代謝和排泄方面的差異，是導致兒童/青少年患者與成年人群毒性反應敏感性不同的主要原因。因此，試驗中包含TK 參數非常重要。通常一般毒理試驗中會設置衛星組，采血時間點通常設置在首末次給藥。另外，由于幼齡動物采血量有限，TK方法開發時盡量減少分析所用樣本體積，能實現微量檢測當然最好，否則TK衛星組可能要設置比較多的動物用于采血。還有一點需要注意，由于動物在快速發育，這其中就包括前述代謝酶、轉運體，所以幼齡動物研究周期中的TK暴露量可能會出現較大的波動。
分組設計方面，由于幼齡動物通常在離乳前即開始給藥，必須考慮同窩幼仔的分組問題。常用的分組方法包括分窩設計（split-litter design）、整窩設計（whole-litter design）、交叉哺育（cross-fostering）。分窩設計指同一窩幼仔平均分配到各劑量組（in split-litter design, all dose levels should be equally represented within a litter），缺點是有交叉污染的風險。整窩設計指每窩幼仔接受同一劑量給藥（in whole-litter design, all pups from the same litter get the same dose），優點是解決了交叉污染風險，缺點是無法排除窩效應和遺傳效應的影響。交叉哺育可以最小化窩效應和遺傳效應影響，但又會存在非自然哺育引入的哺育效應的問題。當然，如果不涉及離乳前用藥，分組需要考量的因素就會簡化很多。
ICH S11推薦的分組方案是先構建標準窩，大多數幼仔與自然母親仍然在一起，每窩幼仔數標準化（比如5雌5雄），10窩為1個劑量組，下圖所示就是1個劑量組的動物組成，A-J代表10窩，每窩10只動物，5雌和5雄代表了5個亞組，分別用于不同的試驗目的，有的是給藥結束剖檢用，有的是TK用，有的是CNS行為學評估用。這種設計有點類似整窩設計，通過多窩組合減少窩效應和遺傳效應等混雜因素影響。
檢測指標：通常，幼齡動物毒理研究需要關注出生后器官發育的影響比如骨骼、腎臟、肺、神經、免疫系統和生殖系統。終點指標應包括很多生長相關指標如冠臀長度、股骨和脛骨長度、性成熟的外部指征、體重、體征、臨床病理學、器官重量、大體解剖和鏡檢。下圖摘自黃芳華、王慶利等CDE老師發表的《幼齡動物毒理學研究: 試驗設計、實施和結果分析》一文，除了常規指標，還需要結合藥物的靶點生物學特征、前期成年動物毒理學數據、臨床使用等case by case的設置針對性特殊評價指標。
最后
幼齡動物的非臨床研究非常復雜。首先，對于是否需要開展附加的幼齡動物非臨床研究進行系統的證據權重分析，不是所有兒科臨床研究均需要幼齡動物數據支持。其次，動物給藥初始年齡選擇、給藥持續時間也需要結合臨床擬用人群、動物與人體器官發育的比較等進行謹慎評估。再就是劑量選擇，并不是劑量越高越好，反而過猶不及，會因為系統毒性影響對器官發育的評估。分組設計較成年動物的考量因素復雜很多，需要排除各種混雜因素的影響。終點指標的檢測除納入成年動物毒理研究所選擇的常規指標，還需對器官系統的發育進行重點研究，某些靶點相關的特殊評價指標也需要結合實際情況case by case分析。簡簡單單一篇文章很難全面、系統的將幼齡動物非臨床研究細節分析透徹，好在ICH、FDA、EMA等已經有多個指導文件出臺，也有大量已經上市的藥物開展過幼齡動物非臨床研究，公開發表的文獻就更多了，足以用來參考。
