通常樣品基質(zhì)復(fù)雜，檢測中普遍存在的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)是分析結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度的關(guān)鍵因素，影響LC-MS/MS檢測結(jié)果靈敏度和準(zhǔn)確度的主要因素也是基質(zhì)效應(yīng)，所以，今天我們就聊一聊如何有效消除LC-MS/MS基質(zhì)效應(yīng)。

什么是基質(zhì)效應(yīng)？

化學(xué)分析中，基質(zhì)指的是樣品中被分析物以外的組分。基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。例如，溶液的離子強度會對分析物活度系數(shù)有影響，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect)。

LC-MS/MS分析中非目標(biāo)分析物作為樣品中的共流出物，對目標(biāo)分析物的離子化會產(chǎn)生影響和干擾，這些影響和干擾就是基質(zhì)效應(yīng)。

基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生機制

在LC-MS/MS中，基質(zhì)效應(yīng)是由于非目標(biāo)分析物與目標(biāo)物共同流出噴霧針，對電荷產(chǎn)生競爭，它們將產(chǎn)生的霧滴牢牢吸在一起，阻止其分裂成更小的微滴，改變了帶電霧滴的表面張力，從而導(dǎo)致目標(biāo)物的離子化效率降低或增強，引起響應(yīng)降低或增高，便產(chǎn)生了所謂的基質(zhì)抑制效應(yīng)或基質(zhì)增強效應(yīng)。

基質(zhì)效應(yīng)的來源

基質(zhì)效應(yīng)主要來源于生物樣品的內(nèi)源性組分，經(jīng)前處理后仍存在于提取液中。包括離子顆粒物成分(電解質(zhì)、鹽類)、強極性化合物(酚類、色素)和各種有機化合物(糖類、胺類、尿素、脂類、肽類及其分析目標(biāo)物的同類物及其代謝物)。

其中磷脂是最主要的內(nèi)源性組分, 其對電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離 (APCI)均會產(chǎn)生離子抑制作用。含有P=O、-O-CO-NH-、OH、R-NH-、-N=、-NH-CO-NH- 等基團的農(nóng)藥通常表現(xiàn)出較強的基質(zhì)效應(yīng)。由樣品處理過程引入的外源性組分，同樣會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。主要包括無機離子、緩沖溶液、有機酸、離子對試劑、增塑劑、表面活性劑殘留、固相萃取（SPE）小柱材料及色譜柱固定相流失物等。

基質(zhì)效應(yīng)的評價

LC-MSMS分析方法的基質(zhì)效應(yīng)評價方法主要有兩種，分別為柱后注入法（Post-column infusion method）和提取后加入法（ Post-extraction spike method）。

方法一：柱后注入法

柱后注入法評價LC-MS方法中的基質(zhì)效應(yīng)流程圖

柱后注入法的優(yōu)缺點：

優(yōu)點：可以實時看到各個分析時間段的基質(zhì)效應(yīng)情況。

缺點：

不能量化基質(zhì)效應(yīng)是其最大弱點。（其實在實際分析過程中，我們更關(guān)注的是基質(zhì)效應(yīng)的量化，尤其是相對量化基質(zhì)效應(yīng)）

柱后注入法不能評價低濃度分析物水平的基質(zhì)效應(yīng)，如LLQC濃度水平。因為目標(biāo)分析物是通過注射泵直接注入質(zhì)譜的，所以低濃度水平信號很難測到。

方法二：提取后加入法

提取后加入法評價LC-MS方法中的基質(zhì)效應(yīng)流程圖

提取后加入法的優(yōu)缺點：

優(yōu)點：可以實現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)的量化評價，目前各法規(guī)文件上采用的評價基質(zhì)效應(yīng)的方法。

缺點：暫無。

看到這里，細(xì)心的小伙伴們就會有這樣一個疑問：在我們?nèi)粘５腖C-MS分析方法中，我們大都是用內(nèi)標(biāo)法去定量的，其實內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)也會影響到定量的準(zhǔn)確性，那么這時候我們該怎么去評價方法的基質(zhì)效應(yīng)呢？

在藥典2015版四部通則9012生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則中就用內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子去評價這種情況下的基質(zhì)效應(yīng)。

對于每批基質(zhì)，應(yīng)該通過計算基質(zhì)存在下的峰面積（由空白基質(zhì)提取后加入分析物和內(nèi)標(biāo)測得），與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積（分析物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤海┍戎担嬎忝恳环治鑫锖蛢?nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子。進(jìn)一步通過分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，計算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。從 6 批基質(zhì)計算的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)不得大于 15%。該測定應(yīng)分別在低濃度和高濃度下進(jìn)行。

基質(zhì)效應(yīng)的消除和補償

1、樣品前處理

改進(jìn)前處理方法、純化樣品、盡可能地減少終提取液中的基質(zhì)成分是有效、徹底地消除基質(zhì)效應(yīng)的方法。

生物樣品的前處理方法很多，研究普遍認(rèn)為利用蛋白質(zhì)沉淀法或稀釋法處理的樣品，其基質(zhì)效應(yīng)明顯高于SPE或LLE方法。

盡管樣品前處理過程繁瑣，但樣品純化仍是最佳的基質(zhì)效應(yīng)消除方法。

傳統(tǒng)的消除基質(zhì)效應(yīng)的前處理方法有：蛋白質(zhì)沉淀(PPT)、液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、樣品稀釋(或減少進(jìn)樣量)等。

2、同位素內(nèi)標(biāo)

同位素內(nèi)標(biāo)不但可抵消質(zhì)譜離子化時的基質(zhì)效應(yīng)，還可消除樣品前處理過程中的差異。

但同位素內(nèi)標(biāo)購置困難，且在多個分析物同時檢測時，由于存在極性差異，即使是同類物的同位素內(nèi)標(biāo)也很難抵消基質(zhì)效應(yīng)，造成定量結(jié)果偏差。

3、色譜分離

合適的色譜分離也可降低基質(zhì)效應(yīng)。

采用柱后法確定基質(zhì)效應(yīng)的出現(xiàn)時間，即可調(diào)整色譜條件，使分析物避免在此段時間內(nèi)出峰。

此方法在高通量分析時無法使用，但可用快速梯度的方法將分析物與溶劑分離。

4、質(zhì)譜分析

基質(zhì)效應(yīng)隨離子源、離子化模式和儀器的不同而不同。

修正質(zhì)譜分析是一種比較易行的方法，無需改變樣品的前處理和色譜條件。

雖然APCI同樣存在基質(zhì)效應(yīng)，但是對于特定的化合物，特別是對于蛋白質(zhì)沉淀法處理的樣品，若采用ESI有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，但可能該基質(zhì)并不影響APCI的離子化。

另外，APPI因其離子化機制不同于APCI和ESI，也不會產(chǎn)生相似的基質(zhì)效應(yīng)。

5、采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液, 即將空白樣品經(jīng)前處理后，加入一定量待測物標(biāo)準(zhǔn)，用以對檢測結(jié)果進(jìn)行校正。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正，是最常用的補償基質(zhì)效應(yīng)的方法。在國內(nèi)外液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法研究中應(yīng)用十分廣泛。

總結(jié)

綜上所述，在具體的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法開發(fā)過程中，首先要根據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)、基質(zhì)類型、檢出限要求等對前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，比較多種前處理方法的凈化效果，兼顧基質(zhì)效應(yīng)和回收率，盡可能多的消除可引起基質(zhì)效應(yīng)的內(nèi)源性物質(zhì)；

其次，選擇合適的離子源并對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到最優(yōu)的分離效果，避免共流出物的影響。選擇合適的內(nèi)標(biāo)物、采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正是對產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)的補償，以抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響，是在前處理以及儀器條件無法消除基質(zhì)效應(yīng)的情況下的補償措施，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。