流行病等細菌感染相關疾病是對公共衛生的主要威脅，已成為全球的十大死亡原因之一。因此，迫切需要新的、高效的策略來對抗細菌感染，并有大量的努力致力于開發替代抗菌劑。抗菌劑的殺菌效果如何，需要通過一系列體外抗菌實驗來驗證。那么表征抗菌劑抗菌效果的方法有哪些，你知道嗎？
一、平板計數法
1.評價標準
抗菌劑對細菌進行殺菌處理以后，將細菌稀釋到合適的倍數進行平板涂布并對長出的菌落進行計數。通過計算細菌存活率或者致死率來表征抗菌劑抗菌效果。
計算公式如下：
2.應用：ZnO/C介導的k-卡拉膠偽巴氏殺菌膜用于金柑保鮮[1]
為了對抗食源性微生物引起的金橘腐病，西北農林大學王建龍教授團隊開創了偽巴氏殺菌的概念，并將其與包裝技術相結合開發了一種用于儲存和保存金橘的新型抗菌包裝膜。首先構建了具有優異光熱性能的鋅摻雜碳納米顆粒（ZnO/C），然后將其加入k-卡拉膠（KC）基質作為填充物中，得到一系列ZnO/C-KC納米復合薄膜。ZnO/ C-KC薄膜由于近紅外誘導的光熱效果與ZnO組分之間的協同殺菌作用而表現出優異的抗菌性能（抗菌率≥99.8%），其中薄膜殺菌的平衡溫度（60–62 ℃）和保溫時間（5 min）顯著低于傳統巴氏殺菌。
通過平板涂布實驗，以大腸桿菌（E. coli）和單核增生李斯特菌（L. monocytogenes）分別作為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的典型模型，評價了ZnO/C-KC膜的偽巴氏殺菌活性。與對照組相比，單獨的KC膜處理使E. coli和L. monocytogenes的存活率略有下降（下降約7%），而NIR輻射對KC膜的抗菌活性沒有顯著影響。對于ZnO/C-KC納米復合薄膜，在沒有NIR輻射的情況下，觀察到劑量依賴的殺菌效果。由于ZnO的存在，E. coli的存活率從94.0%下降到21.7%，L. monocytogenes的存活率從93.1%下降到36.8%。當ZnO/C-KC薄膜暴露于NIR輻射后，由于觸發的光熱治療（PTT）與ZnO固有的抗菌特性之間的協同作用，它們對兩種菌株均表現出顯著增強的抗菌活性。
二、活死染色法
1.評價標準
對細菌進行活死染色也是一種常用的表征抗菌效果的方法。抗菌劑對細菌進行處理后，再對細菌進行活死染色。目前有許多品牌的細菌活死染色試劑盒，以SYTO-9和PI為例，SYTO-9是一種能夠透過細胞膜的綠色熒光核酸染料，可用于活的和死的真核細胞的RNA和DNA染色，以及革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌。PI是一種可對DNA染色的細胞核染色劑，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整細胞膜，但對凋亡晚期細胞和死細胞的破損細胞膜能夠穿透，并使細胞核紅染。
染色結果如下：
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細菌狀態 |
SYTO-9（綠） |
PI（紅） |
染色效果 |
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活且無凋亡和細胞膜損傷 |
+ |
- |
綠色 |
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活但出現凋亡和細胞膜損傷 |
+ |
+ |
黃綠色（紅綠重疊） |
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死（凋亡和細胞膜損傷） |
- |
+ |
紅色 |
+：陽性結果；-：陰性結果
2.應用：氧空位介導的α-MoO3殺菌納米催化劑[2]
在表面分子水平上了解納米材料的細菌失活機制，對于開發抗菌材料及其在抑制病原微生物傳播中的應用具有重要意義。中國科學院氣溶膠化學與物理重點實驗室黃宇研究員團隊制備了一種氧空位介導的殺菌納米催化劑α-MoO3，該催化劑在黑暗中對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性。通過操縱α-MoO3的表面結構，可以輕松地實現超氧自由基（?O2-）的生成。?O2-通過攻擊脂多糖（LPS）和磷脂酰乙醇胺（PE）來破壞細菌的細胞膜。
采用紅色熒光碘化丙啶（PI）核酸染色和綠色熒光核酸染料（SYTO-9）進行熒光細胞活/死試驗，驗證所制備的抗菌劑的抗菌性能。未處理的細菌顯示出密集的綠色熒光。經α-MoO3-0處理后，只能觀察到少量的紅色熒光菌。經α-MoO3-120處理后，幾乎所有細胞均染成紅色，提示細菌細胞膜受損，細菌死亡。
三、掃描電鏡表征法
1.評價標準
抗菌劑對細菌進行處理后，可能會引起細菌形態的變化，如褶皺凹陷或者破損。因此通過拍攝掃描電鏡觀察細菌形態也是表征抗菌劑抗菌效果的手段之一。
2.應用：具有高度生物相容性的銀納米團簇增強傷口敷料[3]
西北工業大學尚利教授團隊開發了一種具有增強協同抗菌能力的高生物相容性銀納米團簇增強水凝膠。將具有生物活性的姜黃素引入到溶菌酶保護的超小銀納米簇中，并通過多重相互作用力進一步與海藻酸鈉（Sa）水凝膠整合。LC-AgNCs的殺菌作用在于其破壞細菌膜、產生活性氧(ROS)、耗盡谷胱甘肽和破壞促氧化-抗氧化系統的能力。姜黃素可以調節細胞內ROS平衡，保護NIH 3T3細胞免受氧化應激，改善LC-AgNCs@Sa的生物相容性。具有長期抗菌能力的LC-AgNCs@Sa由于其抑制炎癥因子（TNF-a）產生、促進膠原沉積和促進再上皮化的獨特功能，可有效保護傷口免受體內細菌入侵，并顯著加速傷口愈合過程。這項研究為設計用于廣泛感染性疾病治療的高性能抗菌敷料提供了一種新的通用的策略。
如圖所示，LC-AgNCs處理前的E. coli呈清晰的桿狀，表面光滑，結構完整。經LC-AgNCs處理后，細菌表面起皺，附近許多細菌的膜融合，表明細菌嚴重塌陷。對S. aureus也觀察到類似的結果，這意味著LC-AgNCs的處理可以顯著破壞細菌膜的完整性。
四、清除生物膜
1.評價標準
近年來，隨著醫學界對某些環境中常見細菌所致的一些慢性和頑固性疾病的深入了解，發現生物膜（生物被膜）是導致這些細菌性疾病難以根治的主要原因。以生物膜形式存在的細菌對抗生素等殺菌劑、惡劣環境及宿主免疫防御機制有很強的抗性，因此評價抗菌劑對生物膜的抑制效果也是評價抗菌劑殺菌效果的標準之一。通過結晶紫染色觀察生物膜剩余面積或者測其OD值可以表征抗菌劑對生物膜的抑制效果。另外也可以用過熒光共聚焦成像來表征對生物膜的抑制效果。
2.應用：介孔二氧化硅納米復合材料具有尖峰納米拓撲結構和增強的生物膜抑制性能[4]
澳大利亞昆士蘭大學余承忠教授團隊報道了一種“雙活性模板”策略用于二氧化硅復合材料的設計。該策略使用陽離子和陰離子結構導向劑作為雙模板，兩者都具有活性抗菌性能。陽離子-陰離子雙活性模板策略有助于開發具有尖刺表面的抗菌納米復合材料。通過雙活性抗菌劑的可控釋放，該納米復合材料對表皮葡萄球菌顯示出增強的抗菌和抗生物膜特性。
通過檢查納米復合材料抑制細菌表面粘附和生物膜形成的效率，進一步評估了納米復合材料的生物膜抑制性能。將納米復合物或BAC/NaSal添加到浮游細菌中，用結晶紫染色來觀察不同處理組的剩余生物膜，如圖所示，對照組和納米復合材料II組顯示深紫色，表明更多的生物膜形成，BAC/NaSal或納米復合材料I處理組表現出明顯較淺的顏色，表明其具有抑制生物膜形成的能力。歸一化結果顯示，納米復合材料I的抑制效果顯著（33%）優于納米復合材料II（85%）和BAC/NaSal（63%）。為了更好地分析生物膜的厚度，采用三維共聚焦顯微鏡對LIVE/DEAD細菌進行染色和分析。未經處理的生物膜的厚度估計為25 μm。在納米復合材料I孵育24小時后，觀察到更薄的生物膜（<10 μm），死亡細胞數量顯著增加（>90%）。而在BAC/NaSal（約15 μm）或納米復合II（22 μm）處理組上形成較厚的生物膜。以上結果表明，“雙活性模板”納米復合材料I在抑制生物膜形成方面表現出良好的協同作用。
參考文獻
1.Zhang L, Wang W, Ni Y, et al. ZnO/C-mediated k-carrageenan based pseudo-pasteurization films for kumquat preservation[J]. Food Hydrocolloids, 2022, 128: 107582.
2.Gao Q, Wang Z, Rao Y, et al. Oxygen vacancy mediated α-MoO3 bactericidal nanocatalyst in the dark: Surface structure dependent superoxide generation and antibacterial mechanisms[J]. Journal of Hazardous Materials, 2023, 443: 130275.
3.Wang T, Li Y, Liu Y, et al. Highly biocompatible Ag nanocluster-reinforced wound dressing with long-term and synergistic bactericidal activity[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2022.
4.Song Y, Sun Q, Luo J, et al. Cationic and Anionic Antimicrobial Agents Co-Templated Mesostructured Silica Nanocomposites with a Spiky Nanotopology and Enhanced Biofilm Inhibition Performance[J]. Nano-micro letters, 2022, 14(1): 1-11.
