前言

色譜分離是建立HPLC方法的首要考慮因素，深刻理解實(shí)驗(yàn)色譜參數(shù)如何影響分離效果，可以很好的幫助我們建立分析方法，運(yùn)用HPLC技術(shù)解決研發(fā)過程中遇到的分析問題。

反相色譜方法（RPC）開發(fā)的一個(gè)重要開始起點(diǎn)，是選擇合適的色譜條件，為一個(gè)給定的樣品提供一個(gè)可靠的分離結(jié)果。兩個(gè)色譜峰的分離度通常采用它們的保留時(shí)間和峰寬計(jì)算得到：

Rs=2[tR(j)-tR(i)]/(Wi+Wj)，Wi和Wj代表色譜峰i和j的峰寬。

色譜峰保留因子與保留時(shí)間的關(guān)系：k=(tR-t0)/t0

色譜峰寬、理論塔板數(shù)、保留因子的關(guān)系：W=4N-0.5t0(1+k)

由上面公式，可以導(dǎo)出色譜峰間分離度與保留因子、選擇因子和理論塔板數(shù)之間的簡單關(guān)系：

圖1：分離度公式

分離度可以劃分為三項(xiàng)：a項(xiàng)（第一個(gè)峰的保留因子），b項(xiàng)（分離因子）和c項(xiàng)（柱效或塔板數(shù)）。從這個(gè)公式中可以看出兩個(gè)色譜峰之間的分離度，與峰保留因子、選擇因子和理論塔板數(shù)密切相關(guān)。

通過改變這三項(xiàng)中的任意一項(xiàng)的值，都可以改善峰之間的分離度，其中提高分離選擇性（α），是最有力的方法。

圖1是等度條件下的分離度公式，下圖2是梯度條件的分離度公式。

圖2：分離度公式（梯度）

當(dāng)需要分離多個(gè)色譜峰時(shí)，對(duì)于分離程度最差的一對(duì)色譜峰來說，分離度的要求是R≥2.0。這一對(duì)色譜峰通常被稱為關(guān)鍵色譜峰對(duì)。它們的分離度是方法優(yōu)化關(guān)注的焦點(diǎn)。

方法建立和開發(fā)時(shí)，第一步關(guān)鍵是選擇一根柱效足夠、選擇性較好的色譜柱，色譜柱固定相是影響選擇性最大的因素；依次是改變?nèi)軇┑膹?qiáng)度，使色譜峰保留因子k值落在合適的區(qū)域范圍，優(yōu)化選擇性α，最后是調(diào)整柱子的柱效塔板數(shù)，得到最優(yōu)的分離度和分析時(shí)間。

圖3：色譜參數(shù)對(duì)分離度的影響

1．保留因子k的優(yōu)化

樣品的保留因子k可以通過樣品的保留時(shí)間和方法的死時(shí)間計(jì)算得到，k=(tR-t0)/t0

死時(shí)間t0可以通過色譜柱柱長近似計(jì)算，t0=0.01L，L為色譜柱長度（單位mm）。當(dāng)選定色譜柱后，t0是一個(gè)常數(shù)，因此k值的大小可以通過改變有機(jī)相的組成（B%）來控制。通常k值控制在1≤k≤10范圍比較合適，如圖3。

圖3 相對(duì)分離度與k值的關(guān)系

k=10時(shí)，當(dāng)其它影響因素不變時(shí)，k值的增加幾乎不再改善分離度，只會(huì)延長樣品的保留時(shí)間。當(dāng)分析方法用于制劑分析時(shí)，k≥2時(shí)，目標(biāo)峰可以很好的與一些沒有保留的輔料干擾峰分離。

RPC 的保留會(huì)隨著有機(jī)相比例%B的改變而變化，表達(dá)為：logk=logkw-SФ

Ф是B溶劑的體積（為0.01*%B）,kw是當(dāng)Ф為0時(shí)的保留因子，S為常數(shù)，對(duì)于分子量100-500Da的化合物來講，S≈4。因此Ф每增加0.1個(gè)單位（+10%B），k值相應(yīng)的減少到原來的1/10，或下降2.5倍。反之，Ф每減少0.1個(gè)單位（-10%B），k值相應(yīng)的增加2.5倍。

如例1：80%的流動(dòng)相B作為初始條件，0.3≤k≤0.8。當(dāng)流動(dòng)相B為70%時(shí)，峰1的k=2.5*0.3≈0.8,最后一個(gè)峰為0.8*2.5=2;依次降低有機(jī)相B的比例，找到合適的k值，如c, 1.8≤k≤6.6。

上述計(jì)算中的“2.5倍法測(cè)”只是一個(gè)粗略的方法，能夠給出一個(gè)近似值參考。

例1：分離效果和k隨流動(dòng)相中%B的變化而變化

2．選擇性α的優(yōu)化

選擇性與保留因子間的關(guān)系如：α=k2/k1,色譜峰的選擇性可以通過調(diào)節(jié)它的相對(duì)保留來改變。色譜條件有機(jī)相B%比例、B溶劑類別、柱溫、柱子類型、流動(dòng)相pH值、緩沖液離子濃度、離子對(duì)試劑濃度等對(duì)色譜的相對(duì)保留有影響。

表1：不同分離條件對(duì)保留因子、選擇性和塔板數(shù)的影響。

如例2：B%的改變可以使得k值落在合適的范圍內(nèi)，但需要進(jìn)一步優(yōu)化條件。因此通過調(diào)整B%比例和柱溫，使得六個(gè)色譜峰都達(dá)到了分離的要求，如d。這個(gè)例子是改變選擇性的一個(gè)簡單且典型的示例，通過兩因素兩水平的改變，設(shè)計(jì)四個(gè)實(shí)驗(yàn)，可以達(dá)到優(yōu)化方法的最終要求。

例2：同時(shí)改變B%比例及柱溫來優(yōu)化分離度

目前市場(chǎng)上有一些方法開發(fā)的軟件，如Drylab,ACD lab，可以進(jìn)行方法開發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，兩個(gè)或三個(gè)因素，兩個(gè)或三個(gè)水平的變化，得到的分析數(shù)據(jù)通過專業(yè)軟件，建立分離度與因素和水平之間的模型，預(yù)測(cè)分離度在哪個(gè)范圍條件下可以達(dá)到最優(yōu)的結(jié)果。

3．色譜柱柱效優(yōu)化

根據(jù)上圖1分離度公式，色譜柱塔板數(shù)的提高可以改善色譜峰間的分離度。通過改變色譜柱的長度、粒徑和流速，可以改善塔板數(shù)N。

理論塔板數(shù)公式：N=16(tR/W)2，N=(1/H)L。

一般情況柱子塔板數(shù)的提高，意味著保留時(shí)間的延長。延長色譜柱、減小粒徑和降低流速都可以增加理論塔板數(shù)。延長色譜柱和減小粒徑的條件改變，會(huì)提高系統(tǒng)的壓力，這個(gè)需要分析工作者注意。

在以前的很長一段時(shí)間，由于色譜柱填料是5μm，分析實(shí)驗(yàn)室喜歡使用長度為250mm的色譜柱，來提高柱效和分離。隨著色譜柱和分析技術(shù)的提高，實(shí)驗(yàn)室很少有通過延長色譜柱來提高分離效果，現(xiàn)在是通過使用較小粒徑（2.7μm,3.0μm,3.5μm）色譜柱，優(yōu)化保留因子和選擇性來獲取較短實(shí)驗(yàn)時(shí)間及滿意的分離。

4.小結(jié)

分析方法的開發(fā)包括分析目標(biāo)的選擇和樣品組成，樣品的處理，色譜模式的選擇，檢測(cè)器的選擇，分離條件的選擇，以及潛在問題的評(píng)估和解決。

分離度的提高可以通過優(yōu)化保留因子、選擇性和柱效三個(gè)因素，其中選擇性的改變是最重要的因素，影響選擇性的第一要素是色譜柱固定相。優(yōu)化有機(jī)相B%的比例和柱溫兩個(gè)影響因素，一般不復(fù)雜的規(guī)則樣品可以找到滿足目標(biāo)的分離條件。對(duì)于復(fù)雜不規(guī)則樣品，需要通過更多的因素和水平的優(yōu)化，評(píng)估樣品的疏水性（LogP,LogD）和pKa,選擇合適的流動(dòng)相pH值，通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)知識(shí)，評(píng)估多因素和多水平的參數(shù)，建立模型，最終選擇最優(yōu)的分析條件，達(dá)到分析的目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

1．現(xiàn)代液相色譜技術(shù)導(dǎo)論，陳小明等

2．HPLC方法開發(fā)的top3 Tips，愛色譜