對(duì)于研發(fā)人員和生產(chǎn)企業(yè)必須能夠克服的技術(shù)難題就是制備出穩(wěn)定的免疫金復(fù)合物。

免疫金標(biāo)記技術(shù)是一種將膠體金顆粒與包括抗原、抗體在內(nèi)的許多蛋白質(zhì)標(biāo)記形成免疫金復(fù)合物的技術(shù)。雖然這種免疫金標(biāo)記技術(shù)呈 現(xiàn)出多種多樣的應(yīng)用方式，但目前主要應(yīng)用是以快速檢測(cè)試紙盒的形 式使用于疾病的診斷和監(jiān)測(cè)。

在過(guò)去的十年里，基于膜上的快速診斷技術(shù)（包括側(cè)向?qū)游龊蜐B濾兩種形式）的發(fā)展為金標(biāo)免疫試劑創(chuàng)造了巨大的市場(chǎng)。使用該技術(shù) 制備的標(biāo)記物作為檢測(cè)系統(tǒng)中的指示試劑使用在檢測(cè)敏感癥、傳染病、 環(huán)境污染物、毒品、心梗標(biāo)志物、早孕以及獸醫(yī)等領(lǐng)域。

如同其他標(biāo)記結(jié)合物一樣，獲得成功的結(jié)果必須通過(guò)采用優(yōu)質(zhì)的試劑（蛋白質(zhì)和膠體金）、豐富的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)和對(duì)標(biāo)記物產(chǎn)品最終結(jié)果分析的完整的知識(shí)結(jié)構(gòu)，這需要掌握以下知識(shí)要點(diǎn)。

1、蛋白質(zhì)的標(biāo)記

在體外診斷應(yīng)用領(lǐng)域，通常采用抗原或抗體與免疫金結(jié)合制備免疫金結(jié)合物。采用單克 隆抗體或多克隆抗體，是影響抗體標(biāo)記的因素之一。

雖然診斷產(chǎn)品中大多數(shù)抗體標(biāo)記采用 IgG 抗體，但 IgM、IgE 和 IgA 抗體也可以成功標(biāo)記上膠體金。標(biāo)記時(shí)，進(jìn)一步必須考慮抗體的亞型。在鼠抗IgG亞型中，例如 IgG1 亞型成 功率高，而 IgG3 亞型被證實(shí)有技術(shù)難度。

將抗原標(biāo)記膠體金也面臨技術(shù)難題。將常見(jiàn)的抗原標(biāo)記上膠體金比較容易。但是受抗原 與膠體金結(jié)合方式的影響，金標(biāo)記覆蓋的蛋白反應(yīng)決定簇小于50%時(shí)才能高成功率制備出標(biāo) 記物。因此，考慮蛋白結(jié)合金的方式對(duì)標(biāo)記開(kāi)發(fā)人員非常重要。

2、聯(lián)接機(jī)理

研究人員普遍接受的理論為，三種特異的氨基酸殘基在金顆粒與蛋白質(zhì)的聯(lián)接作用中發(fā) 揮著重要的作用。而賴氨酸、色氨酸和半胱氨酸這三種氨基酸與膠體金聯(lián)接的作用機(jī)理各不相同。

賴氨酸帶有較強(qiáng)的正電荷，因而自然吸附帶負(fù)電荷的金顆粒；

色氨酸主要通過(guò)疏水相互作用與膠體金相聯(lián)接；

半胱氨酸通過(guò) SH-與金表面以共用電子的形式形成配位鍵。

抗體通過(guò)這幾種作用力與膠體金顆粒牢固、穩(wěn)定的、不易分離的結(jié)合在一起。在很大程度上，標(biāo)記成功與否取決于上述三種氨基酸殘基在被標(biāo)記蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)。

在某種情況下，氨基酸聯(lián)接于蛋白質(zhì)的活性部位，從而干擾蛋白質(zhì)的反應(yīng)活性。空間位阻的限制，當(dāng)這幾種氨基酸殘基定位于抗體的抗原結(jié)合部位或抗原的特異抗體結(jié)合決定簇部位時(shí)，可能出現(xiàn)這種類型的干擾。如果被標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子未做特定的處理就幾乎不可能克服這種干擾。

為了在免疫檢測(cè)中獲得最佳的靈敏，這三種與標(biāo)記相關(guān)氨基酸的正確結(jié)合是非常重要的。就標(biāo)記抗體來(lái)說(shuō)，這三種氨基酸應(yīng)定位于 Fc 區(qū)，而對(duì)于標(biāo)記抗原，它們應(yīng)遠(yuǎn)離抗原的反應(yīng)決定簇位置。

3，標(biāo)記方法的調(diào)試

為了開(kāi)發(fā)、優(yōu)化單一標(biāo)記的膠體金結(jié)合物，研究人員通常制備小批量的多達(dá)60批次的不 同膠體金結(jié)合物。每批次膠體金結(jié)合物在某一關(guān)鍵制備步驟上都與其它不同，各批次都被測(cè) 試從而確定哪種標(biāo)記技術(shù)對(duì)于最終的檢測(cè)分析可能獲得最佳的反應(yīng)結(jié)果。

這類調(diào)試應(yīng)該包括所有可以改善膠體金結(jié)合物的靈敏度、交叉反應(yīng)以及潛在穩(wěn)定性的技 術(shù)參數(shù)。典型的測(cè)試應(yīng)包含但不應(yīng)僅限于抗體工作緩沖液、防腐劑的類型、鹽度、表面活性 劑含量、膠體金顆粒的尺寸、封閉劑的類型、總蛋白濃度、結(jié)合物工作緩沖液以及結(jié)合物的 濃度。為了確定不同封閉劑的效果，建議考慮以下調(diào)試內(nèi)容：

•封閉劑的類型（如酪蛋白、BSA、卵清蛋白、人血清白蛋白、PEG、非特異性 IgG）

•封閉劑的純度

•封閉劑的含量

•封閉劑對(duì)整個(gè)測(cè)試反應(yīng)的兼容性

研發(fā)人員應(yīng)該根據(jù)在原型產(chǎn)品上的量的調(diào)節(jié)試驗(yàn)結(jié)果確定上述所有試驗(yàn)指標(biāo)最佳值。最后，無(wú)論如何，唯 一的檢測(cè)方式是將結(jié)合物應(yīng)用于盡可能模仿最終測(cè)試條 件制做出來(lái)的小型測(cè)試條前期產(chǎn)品中。對(duì)于基于膜基礎(chǔ) 上的檢測(cè)分析來(lái)說(shuō)，最簡(jiǎn)易的方法是使用半試紙條形式 來(lái)做檢測(cè)，僅需要使用捕獲抗體和純抗原。在 使用這種簡(jiǎn)單的測(cè)試形式下，很多小批量結(jié)合物就能被評(píng)估得到比較合適的測(cè)定結(jié)果，而可以避開(kāi)一些普遍的問(wèn)題例如：與干燥相關(guān)的技術(shù)問(wèn)題或 者樣品緩沖液的問(wèn)題。

為了滿足上述試驗(yàn)的要求，常需要 3mg 抗體或者 5mg 抗原。采用小樣樣本，能夠獲得 最優(yōu)化的膠體金結(jié)合物制備參數(shù)，并能提供初步的評(píng)估樣本。一旦使用優(yōu)質(zhì)的抗體或者抗原 用于標(biāo)記，且確定了制備參數(shù)，生產(chǎn)商就能容易地制備重復(fù)性好和批量化的供選用的結(jié)合物。

4，原料的的好壞

應(yīng)用在制備免疫金結(jié)合物的特異性抗體的穩(wěn)定性主要取決于檢測(cè)試驗(yàn)的技術(shù)條件。對(duì)于側(cè)向?qū)游龇治觯詈玫目贵w形式是采用一般的單克隆配對(duì)。在這類檢測(cè)分析中，一種單克隆抗體被標(biāo) 記膠體金作為指示劑，而另一種被固定于硝酸纖維素膜 上作為捕獲劑。每種抗體對(duì)于抗原表面的不同反應(yīng)決定 簇都應(yīng)該是特異識(shí)別，并且這些抗原決定簇在空間結(jié)構(gòu) 上距離較遠(yuǎn)。

多克隆抗體也可以被使用，但至少是必須經(jīng)過(guò) protein-A 柱層析純化。在多數(shù)情況下，抗體經(jīng)親和層析純化后能制備出具有較高靈敏度和特異性的結(jié)合物。這當(dāng)然取決于符合試驗(yàn)檢測(cè)可接受交叉 反應(yīng)的技術(shù)要求。

親和層析純化 硫酸銨沉淀法或 DEAE 純化的血清，含有大量的雜蛋白將競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合膠體金顆粒表面的 結(jié)合位點(diǎn)。這些雜蛋白擁有高含量的控制蛋白與膠體金結(jié)合的三種氨基酸殘基，很容易與裸 露的膠體金顆粒結(jié)合。出現(xiàn)這種情況時(shí)，檢測(cè)系統(tǒng)中指示劑的靈敏度水平降低。

同理，如果采用經(jīng)A蛋白或G蛋白柱層析純化的抗體，然后IgG片段中可能含有大量的非特異性的IgG，而不是需要的特異性IgG.所有的IgG將與膠體金結(jié)合，結(jié)果可能是低靈敏度。

從親和層析柱上洗脫下的高親和抗體應(yīng)該是高親和抗體，從而可以產(chǎn)生高特異性的膠體 金結(jié)合物。這些抗體可能需要進(jìn)一步的處理以避免交叉反應(yīng)。雖然親和純化法耗費(fèi)大量的時(shí) 間、經(jīng)費(fèi)、血清，但是通過(guò)該方法可以獲取任何免疫分析必需的關(guān)鍵原料——高質(zhì)量的結(jié)合物。

抗原的標(biāo)記 成功制備抗原標(biāo)記物依靠?jī)蓚€(gè)因素：控制抗原與膠體金顆粒聯(lián)接的三種氨基酸殘基的空 間位置和抗原大小。

大多數(shù)的抗原標(biāo)記物是被使用在快速檢測(cè)試紙上，例如血清的雙抗體夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)。

在這種情況下，通常選擇 40nm 膠體金顆粒。直到最近，研究人員發(fā)現(xiàn)，40nm 膠體金顆粒標(biāo)記的蛋白分子量下限為 30KD.然而在某些條件下，通過(guò)先進(jìn)的標(biāo)記技術(shù)可以將該限制 降低到一半至 15KD.使用這些小顆粒標(biāo)記的主要限制是被標(biāo)記蛋白必須包含足夠數(shù)量的賴氨 酸、色氨酸和半胱氨酸殘基。抗原常不含有足夠的半胱氨酸殘基，以至抗原和膠體金顆粒之 間的結(jié)合力相對(duì)較弱且容易斷裂，尤其在樣本中存在高親和力的抗體時(shí)。

對(duì)于分子量低于30KD的抗原，通常采用其他技術(shù)方法，例如標(biāo)記較小的膠體金顆粒。在檢測(cè)線處由于膠體金顆粒過(guò)小使得可見(jiàn)度低很可能導(dǎo)致靈敏度降低。

對(duì)于含有較少或者不含上述三種聯(lián)接氨基酸殘基的抗原，一種有效的解決方法是通過(guò)將抗體與載體分子預(yù)先聯(lián)接，比如BSA或KLH.然而這種技術(shù)不象說(shuō)起來(lái)那么簡(jiǎn)單，不是業(yè)余 的蛋白化學(xué)家所能做到的。必須謹(jǐn)慎考慮使用的聯(lián)接物類型、聯(lián)接物長(zhǎng)度，半抗原與 BSA 的 摩爾比例和載體分子類型等因素，確保暴露抗原活性反應(yīng)決定簇部位的結(jié)合物可重復(fù)制備， 且在測(cè)試中蛋白載體膠體金結(jié)合物具有最大的敏感性。

5，膠體金顆粒大小

膠體金顆粒大小的選擇取決于膠體金結(jié)合物的用途。如下段落描述了兩個(gè)最常用的膠體 金應(yīng)用領(lǐng)域：顯微檢測(cè)技術(shù)和快速診斷技術(shù)。

顯微檢測(cè)技術(shù) 任何1-40nm的膠體金結(jié)合物可以應(yīng)用于電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡檢測(cè) 領(lǐng)域。然而即使在透射電鏡放大25萬(wàn)倍的情況下，也不可能觀測(cè)到1或2nm的膠體顆粒。利用銀增強(qiáng)膠體金技術(shù)可以讓終端客戶能夠看到膠體金標(biāo)記的這種較小的抗原性位點(diǎn)。

銀增強(qiáng)染色技術(shù)是指通過(guò)銀鹽在膠體金顆粒表面沉積，使膠體金顆粒增大到在顯微鏡下能觀察的尺寸。當(dāng)所有的膠體金顆粒都是同樣大小和形狀時(shí)，該方法具有效率高、易控制的特點(diǎn)且低變異系數(shù)。使用如 1-2nm 的膠體金小顆粒時(shí)，由于空間位阻較大的膠體金顆粒不能標(biāo)記的一些抗原決定簇位點(diǎn)，也變得容易接近。因而，一旦確定抗原位置，在銀增強(qiáng)染色技術(shù)作用下，金標(biāo)記變得容易聯(lián)接和形成。

在不采用銀增強(qiáng)染色電鏡技術(shù)的情況下，幾個(gè)不同的抗原反應(yīng)決定簇可能被標(biāo)記在相同的片段上。在這種情況下，采用可分辨出的不同尺寸大小的膠體金標(biāo)記特異性抗 體，該抗體對(duì)不同反應(yīng)決定簇具有特異識(shí)別。

快速診斷技術(shù)（側(cè)向?qū)游龊蜐B濾測(cè)試盒）。對(duì)于該應(yīng) 用方向，最常用的膠體金顆粒是40nm。在標(biāo)記IgG時(shí)，40 nm的膠體金顆粒提供最大的可視性和最小的空間位阻。分子量為160kDa 的IgG分子，長(zhǎng)度大約為 8nm.40-100nm間的膠體金顆粒比較順利標(biāo)記到IgG抗體上。比40nm大的顆粒有較大的可視性，但較大膠體金顆粒在1ml溶液時(shí)520nm吸光度較小，因此較少在檢測(cè)線處被捕獲。綜上所述，同40nm或60nm膠體金標(biāo)記的抗體相比，較大顆粒的膠體金結(jié)合物對(duì)1-10ng/ml分析物具有較低的靈敏度。

60nm膠體金顆粒非推薦使用，但可以應(yīng)用于快速診斷分析。其不同于40nm 膠體金顆粒，顏色偏淺。優(yōu)質(zhì)的40nm膠體金為櫻桃紅色，而60nm膠體金為深粉紅色。在某種情況下，樣品類型可使膜上殘留背景底色，這種輕微的顏色差異可以使信號(hào)容易識(shí)別。比如，含有膽紅素的樣本將留下的背景底色，相對(duì)褐色，粉紅色較紅色容易被識(shí)別。

如果用于標(biāo)記分子的分子量小于160kDa，20nm 膠體金顆粒更適合。20nm 膠體金顆粒通常用于標(biāo)記鏈霉親和素、A 蛋白和抗原，這些被標(biāo)記蛋白的分子量小于60kda。

6，靈敏度 

隨著快速診斷技術(shù)進(jìn)步使膠體金結(jié)合物的靈敏度得到提高。目前，在大多數(shù)快速診斷分析中，檢測(cè)下限達(dá)到1ng/ml.如果優(yōu)質(zhì)抗體，可以低到10pg.然而隨著銀增強(qiáng)技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)靈敏度將進(jìn)一步提高，可能提高10-100倍。后續(xù)我將會(huì)推出如何提高靈敏度。

膠體金蛋白質(zhì)結(jié)合物的制備過(guò)程并非輕而易舉的。制備優(yōu)質(zhì)的膠體金結(jié)合物過(guò)程以及缺 乏經(jīng)驗(yàn)的生產(chǎn)商將面臨產(chǎn)品批次的重復(fù)性、規(guī)模擴(kuò)大等技術(shù)難題。