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嘉峪檢測網(wǎng) 2021-04-18 15:52
代謝組學(xué)是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想，對生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系的研究。代謝組學(xué)的研究需要高靈敏度、高通量且穩(wěn)定性好的方法，所以檢測平臺的選擇也是至關(guān)重要，今天就和大家聊一聊代謝組學(xué)和代謝組學(xué)的研究檢測技術(shù)。
我們知道細(xì)胞內(nèi)的生命活動由眾多基因、蛋白質(zhì)、以及小分子代謝產(chǎn)物來共同承擔(dān)，而上游的（核酸、蛋白質(zhì)等）大分子的功能性變化最終會體現(xiàn)于代謝層面，如神經(jīng)遞質(zhì)的變化、激素調(diào)控、受體作用效應(yīng)、細(xì)胞信號釋放、能量傳遞和細(xì)胞間通訊等，所以代謝組處于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)的下游，所提供的是生物學(xué)的終端信息。如同我們在長江的上游建大壩或?qū)牡溃@些項目的生態(tài)影響會在下游的河道和地域體現(xiàn)出來一樣，我們經(jīng)常說，基因組學(xué)和蛋白組學(xué)告訴你可能發(fā)生什么，而代謝組學(xué)則告訴你已經(jīng)發(fā)生了什么。
代謝組學(xué)（Metabonomics/Metabolomics）是20世紀(jì)90年代末期發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，是研究關(guān)于生物體被擾動后（如基因的改變或環(huán)境變化后）其代謝產(chǎn)物（內(nèi)源性代謝物質(zhì)）種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)。代謝組學(xué)著重研究的是生物整體、器官或組織的內(nèi)源性代謝物質(zhì)的代謝途徑及其所受內(nèi)在或者外在因素的影響及隨時間變化的規(guī)律。代謝組學(xué)通過揭示內(nèi)在和外在因素影響下代謝整體的變化軌跡來反映某種病理生理過程中所發(fā)生的一系列生物事件。
一般來說，代謝組學(xué)關(guān)注的對象是分子量在1000以下的小分子化合物。根據(jù)研究的對象和目的不同，科學(xué)家將生物體系的代謝產(chǎn)物分析分為4個層次：
某一個或幾個特定組分的定性和定量分析，如某一類結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相關(guān)的化合物（氨基酸、有機(jī)酸、順二醇類）或者某一代謝途徑的所有中間產(chǎn)物或多條代謝途徑的標(biāo)志性組分。
同時對多個代謝物進(jìn)行分析，不分離鑒定具體單一組分。
限定條件下對生物體內(nèi)特定組織內(nèi)的代謝產(chǎn)物的快速定性和半定量分析。
對生物體或體內(nèi)某一特定組織所包含的所有代謝物的定量分析，并研究該代謝物組在外界干預(yù)或病理生理條件下的動態(tài)變化規(guī)律。
代謝組學(xué)主要研究的是作為各種代謝路徑的底物和產(chǎn)物的小分子代謝物（分子量<1000）。其樣品主要是血漿或血清，尿液，唾液，以及細(xì)胞和組織的提取液。
不同的質(zhì)譜平臺靈敏度及偏向性都不一樣，而且不同平臺之間具有互補(bǔ)性。一般來說GC/MS檢測血清樣品能準(zhǔn)確定性的物質(zhì)約200個左右，檢測尿液樣品定性的物質(zhì)約200個左右，其他樣品（如肝臟，糞便，腸道內(nèi)容物）也在幾百這個數(shù)量級。如果采用全二維GC/MS，物質(zhì)的數(shù)量要更多，可達(dá)1千以上。LC/MS檢測物質(zhì)的數(shù)量要遠(yuǎn)比GC/MS多，但能準(zhǔn)確定性和定量的不多，視不同的平臺(TQ、QTOF等)能達(dá)到幾十至2-3百個物質(zhì)。
選用高靈敏度和高選擇性以及能夠檢測大多數(shù)代謝物的技術(shù)；
在給定的生物樣品中，能夠提供高度可重復(fù)性且低成本。
目前沒有一種分析工具具備上述所有特征，但目前應(yīng)用最廣泛的代謝組學(xué)方法：
核磁共振波譜（NMR）和質(zhì)譜（MS）與氣相色譜（GC）、液相色譜、（LC）或毛細(xì)管電泳（CE）聯(lián)用。
然而，這些分析平臺都不能單獨(dú)提供生物樣品中整個代謝組的全面鑒定和量化，因為每種不同技術(shù)都有一系列優(yōu)缺點(diǎn)。
核磁共振波譜（NMR）應(yīng)用于代謝組學(xué)，采用的是非靶向的方法，關(guān)注的是整體全局的代謝情況。非靶向代謝譜分析目的：通常用于鑒定和相對量化代謝物，這些代謝物依據(jù)分類，具有不同的功能。
這種方法通常與生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)、診斷和與疾病病理生理學(xué)相關(guān)假說的產(chǎn)生有關(guān)。
優(yōu)點(diǎn)：
不必事先知道給定生物樣品的代謝物種類；
缺點(diǎn)：
只對代謝物進(jìn)行半定量，沒有適當(dāng)注釋下，就識別出顯著的峰，使深層機(jī)理和生化的理解復(fù)雜化。
代謝物注釋是確定代謝物結(jié)構(gòu)和功能的過程，代謝物識別能力的局限性一直是代謝物組學(xué)研究的主要障礙之一。
質(zhì)譜（MS）常被用于靶向代謝組學(xué)研究，重點(diǎn)是精確定量和鑒定一組特定的已知代謝產(chǎn)物。
靶向代謝譜分析的目的：
確定并對感興趣的代謝物進(jìn)行絕對定量分析，這是通過光譜匹配到真實(shí)的參考化合物來實(shí)現(xiàn)的，該參考化合物通常作為同位素標(biāo)記化合物加入或用作標(biāo)準(zhǔn)曲線生成的額外標(biāo)準(zhǔn)物。
通常與食品或藥物管理引起的特定代謝物和途徑的變化相關(guān)，是藥物開發(fā)和毒理學(xué)中的重要分析工具。
缺點(diǎn)：
代謝譜僅限于已知的標(biāo)準(zhǔn)代謝物，用這種方法不適合識別新代謝物。
核磁共振波譜：
通過測量振蕩射頻電磁場與沉浸在強(qiáng)外磁場中的原子核的相互作用來研究分子結(jié)構(gòu)。
原理：
有些原子核具有所謂的核自旋值，這使得這些原子核能夠產(chǎn)生核磁矩，因為它們在外部磁場中的行為就像旋轉(zhuǎn)的磁鐵棒。這些原子核相對于外場可以有不同的方向，每個方向都與一個特定的能級有關(guān)。所以，當(dāng)一個質(zhì)子被放置在一個外部磁場中，質(zhì)子的磁矩分裂產(chǎn)生兩個能級：一個高能級和一個低能級。然而，在核磁共振實(shí)驗中，涉及到許多原子核，在平衡狀態(tài)下，一組自旋態(tài)將在高能和低能態(tài)之間產(chǎn)生足以產(chǎn)生凈磁場的能量差。施加電磁能的短脈沖可以誘導(dǎo)能級之間的躍遷，這一過程有助于原子核吸收能量，隨后能量被釋放為離散量子，并在核磁共振譜中記錄為峰值。
每一個峰的位置是通過相對于添加的參比化合物（通常是3-三甲基硅基丙酸鹽（TSP））的化學(xué)位移（ppm）來確定的。根據(jù)化學(xué)位移（在波譜中的位置）和峰值強(qiáng)度，可以確定相對水平和生化物質(zhì)。此外，如果加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)物，則可獲得絕對濃度。
1HNMR譜具有很小的化學(xué)位移范圍（通常為0-10ppm），由于生物化學(xué)物質(zhì)的復(fù)雜行和混合程度，峰的分離程度不高，峰值嚴(yán)重重疊（如，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和低分子量代謝物），使得譜的比對成為一項艱巨任務(wù)。
譜峰重疊問題的克服：
二維（2D） 1H NMR譜增加了信號的離散度，闡明了信號的連接性，從而有助于代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)解釋和鑒定。
常用的2DNMR：
J-resolved核磁共振譜；
擴(kuò)散有序譜（DOSY）；
同核穿透相關(guān)法相關(guān)光譜（COSY）；
全相關(guān)譜（TOCSY）;異核鍵相關(guān)法異核單量子相關(guān)光譜（HSQC）；
異核多平衡相關(guān)譜（HMQC）；異核多鍵相關(guān)譜（HMBC）；
全空間相關(guān)法核超限效應(yīng)譜（NOESY）。
利用異核相關(guān)，例，1H與氮（15N）、碳（13C）或存在磷（31P）的情況下，提供了一種信息途徑，但存在明顯的局限性，即15N（0.37%）和13C（1.1%）的豐度較低，而且大多數(shù)代謝物不含31P。Ø因此，核磁共振波譜的一個固有問題是靈敏度相對較低。
技術(shù)改進(jìn)：
超導(dǎo)低溫探針（探測器冷卻到接近絕對零溫度）、增加磁場強(qiáng)度（目前為900MHz）和低體積微探針，繼續(xù)提高核磁共振波譜的靈敏度。
核磁共振波譜技術(shù)獨(dú)特的優(yōu)勢：
跨實(shí)驗室的高度再現(xiàn)性；
通常允許以無創(chuàng)或微創(chuàng)的方式收集樣品，例如尿液、血液和精液；
需要少量樣品和最少或無樣品制備；快速；無損。
因此，隨著時間的推移，有可能從同一個體中采集多個樣本，從而繪制特定病理生理條件下發(fā)生的代謝變化圖。作為一個獨(dú)特的特征，這些樣品隨后可以重復(fù)用于進(jìn)一步的分析，例如轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等。以上優(yōu)勢同樣適用于高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)（HRMAS）核磁共振波譜（HRMASNMR）。
HRMAS NMR：
基本上是分析完整組織的唯一方法。在沒有任何預(yù)處理的情況下，樣品以54.7°的“魔角”相對于外加磁場快速旋轉(zhuǎn)，這降低了完整組織的核磁共振譜線的展寬，因此與流體獲得的分辨率相當(dāng)。
質(zhì)譜法是通過測量電離分子在磁場中低壓（真空）下的質(zhì)量電荷比（質(zhì)荷比：m/z）來研究分子結(jié)構(gòu)的方法。
質(zhì)譜儀由三個基本組件組成：離子源、質(zhì)譜分析儀和檢測器。
為了避免空氣中分子的影響，真空是必不可少的。
離子源使樣品（氣體、液體或固體）電離，產(chǎn)生分子離子和更小的碎片離子。這些離子通過質(zhì)量分析儀加速，垂直磁場將根據(jù)其質(zhì)量使離子偏轉(zhuǎn)；較重的離子不會像較輕的離子那樣偏轉(zhuǎn)，從而允許質(zhì)量分析儀根據(jù)其質(zhì)量電荷比對離子進(jìn)行排序，最終由檢測器測量。
輸出以質(zhì)譜表示，其中每個峰或條代表一個具有特定m/z（x軸）的離子，峰的長度代表相對豐度。
質(zhì)譜的一個固有問題是只能分析氣相中的離子，電離過程決定了可以區(qū)分的代謝物的類型和數(shù)量。沒有一種單一的電離過程可以涵蓋所有類型的代謝物。
電離技術(shù)：
電子電離（EI）和化學(xué)電離（CI），它們只能電離氣相分子，電噴霧電離（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）適用于熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性分析物，如液體和固體。
其他電離技術(shù)：
快速原子轟擊（FAB）、場解吸（FD）、激光電離（LIMS）和共振電離（RIMS）。
基于MS的代謝組學(xué)的一個關(guān)鍵因素是，如果采用非靶向方法，則獨(dú)立地應(yīng)用不同的電離程序，以實(shí)現(xiàn)最大的代謝物覆蓋率，反之，為靶向研究選擇正確的電離方法。
質(zhì)量分析器根據(jù)離子的質(zhì)荷比對其進(jìn)行排序，并通過磁場或電場對其進(jìn)行分類。
與電離過程一樣，不同的分析儀類型也被開發(fā)出來，每種類型都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。
一些最常用的分析器是飛行時間（TOF）、四極質(zhì)量濾波器、四極離子阱、傅里葉變換離子回旋共振和軌道捕獲。
探測器，它測量通過離子的電荷。
因此，在給定的代謝組學(xué)研究中，必須仔細(xì)選擇質(zhì)譜儀，以獲得高靈敏度和高選擇性，并進(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定。
準(zhǔn)確的分子鑒定可以通過串聯(lián)質(zhì)譜來實(shí)現(xiàn)，串聯(lián)質(zhì)譜是一種能夠進(jìn)行多輪質(zhì)譜的質(zhì)譜儀，可以進(jìn)行碎片研究和非常精確的質(zhì)量測定。
有時，質(zhì)譜儀的一些更常見的配置變得普遍，形成復(fù)合縮寫，如TIMS（熱電離質(zhì)譜）和MALDI-TOF（基質(zhì)輔助激光解吸/電離和飛行時間）。
盡管質(zhì)譜技術(shù)不斷進(jìn)步，但由于可變電離和離子抑制效應(yīng)影響分析物的精確定量，分析高度復(fù)雜樣品時仍然存在一個固有問題。為了部分地彌補(bǔ)這些局限性，采用不同的技術(shù)來降低質(zhì)譜前分析物的復(fù)雜性。
最常用的技術(shù)是色譜和電泳。
液相色譜法使用液體，通常是水和有機(jī)溶劑的混合物，在高壓下工作，因此被稱為高效液相色譜（HPLC）。
在高效液相色譜過程中，給定的樣品在高壓下被液體強(qiáng)制通過色譜柱。柱本身包含一種固體吸附材料，根據(jù)其與吸附材料相互作用程度的不同，該材料將減慢化合物的通過，從而分離單個物質(zhì)，提供不同的保留時間。通過改變色譜柱和液體，可以分離出不同種類的物質(zhì)，然后引入質(zhì)譜儀。
最常用的高效液相色譜法是反相高效液相色譜法（RP-HPLC），但極性和離子性化合物很難用這種方法檢測，這就是為什么親水性相互作用液相色譜法（HILIC）已被開發(fā)用于帶電代謝物的分析。近年來，超高性能LC（UHPLC）已經(jīng)提高了峰值分辨率，提高了速度和靈敏度。
氣相色譜法是一種簡單的色譜法，用于分離和分析揮發(fā)性成分。
氣相色譜儀基本上是一個柱，惰性氣體（通常是氦）通過它在高溫下吹氣。一個給定的樣品會因此蒸發(fā)，揮發(fā)性分子被推過色譜柱，在那里它們與色譜柱的涂層相互作用。每種化合物在通過色譜柱時與涂層發(fā)生不同的相互作用，導(dǎo)致不同的保留時間，從而在揮發(fā)性分子被引入質(zhì)譜儀之前提供有效的分離。
該方法的一個主要優(yōu)點(diǎn)是可以設(shè)計柱分離感興趣的特定分析物，但GC的一個限制和先決條件是分析物在高溫下易揮發(fā)和穩(wěn)定。代謝物的覆蓋范圍可以通過非揮發(fā)性分子的化學(xué)衍生來提高，但代價是在代謝物組學(xué)數(shù)據(jù)中引入另一個變量。然而，許多代謝物仍然不易揮發(fā)，因此不能用GC-MS定量。
毛細(xì)管電泳是代謝組學(xué)中一種相對較新但功能強(qiáng)大的分析工具，它能快速、高分辨率地分析核酸、氨基酸、羧酸和糖磷酸酯等帶電的代謝物質(zhì)。
使用毛細(xì)管電泳，來自給定樣品的帶電分析物將通過電極間電場引發(fā)的毛細(xì)管遷移。帶電分析物根據(jù)其電泳遷移率進(jìn)行分離，這意味著如果兩個帶電分析物具有相同的尺寸，則具有較大電荷的分析物將移動得更快；或者如果兩個分析物具有相同的電荷，則較小的分析物將由于較少的摩擦而移動得更快。
到目前為止，CE-MS主要用于分子的研究，但在處理極性強(qiáng)、帶電荷的代謝物時，CE通常是首選，出于對結(jié)果快速需求。
不同的分析平臺產(chǎn)生了大量復(fù)雜的數(shù)據(jù)。
為了能夠提取出任何有意義的信息，需要對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪、基線校正、峰值對齊、分箱（binning）、標(biāo)準(zhǔn)化（歸一化）和數(shù)據(jù)縮放等預(yù)處理。
正確的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理是獲得有效信息數(shù)據(jù)的前提。
預(yù)處理后的數(shù)據(jù)可以進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)，這是統(tǒng)計方法在化學(xué)系統(tǒng)中的應(yīng)用，目的是提取有意義的信息。
它已經(jīng)成為代謝組學(xué)的一個重要組成部分，因為核磁共振和質(zhì)譜都產(chǎn)生高維數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，與變量（峰或代謝物）相比，觀測（樣品）相對較少，使得這類數(shù)據(jù)適合于多元統(tǒng)計分析。
多元分析工具的目標(biāo)是將數(shù)據(jù)集的復(fù)雜性或維數(shù)降低到一個更易于管理的二維或三維數(shù)。在代謝組學(xué)中，最廣泛使用的技術(shù)是以無監(jiān)督或有監(jiān)督的方式提取潛在變量。
主成分分析（PCA）是最實(shí)用的無監(jiān)督方法，它通過提取主要的變異源，在不知道數(shù)據(jù)所屬類別的情況下，降低了數(shù)據(jù)的復(fù)雜度。
PCA對于檢測異常值和樣本的內(nèi)在聚類非常有用，內(nèi)在聚類對于隨后在分組樣本中識別相似的生物特征非常有用。
偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交PLS-DA（O-PLS-DA）是常用的監(jiān)督方法，能夠發(fā)現(xiàn)兩個矩陣之間的基本關(guān)系，一個X矩陣包含自變量（例如，光譜強(qiáng)度值）來自樣本和包含因變量的Y矩陣（例如，類別、性別、治療反應(yīng)）
PLS-DA和O-PLS-DA通常用于識別不同樣本組之間的生物標(biāo)記物和差異，例如健康組和患病組。
使用PCA、PLS-DA和O-PLS-DA時，存在數(shù)據(jù)過度過濾的風(fēng)險，因此必須進(jìn)行嚴(yán)格的統(tǒng)計驗證。
來源：Internet
