分析方法應(yīng)用在藥物研發(fā)的不同階段，其目標(biāo)與目的各不同，不同藥物研發(fā)階段對(duì)應(yīng)著不同特點(diǎn)的分析方法開(kāi)發(fā)。基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在分析方法開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用越來(lái)越多，它幫助制藥分析人員更多的理解和掌握分析方法知識(shí)，從而不斷提高產(chǎn)品質(zhì)量控制手段和策略。

分析方法開(kāi)發(fā)的不同階段

候選藥物開(kāi)發(fā)階段，分析方法用于支持臨床前的藥物純度與含量的評(píng)價(jià)，處方前研究的評(píng)估，以及原始早期化合物穩(wěn)定性研究。這個(gè)階段分析方法以檢測(cè)為主，基本不需要有過(guò)多的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)，試錯(cuò)法完全可以滿足當(dāng)前階段要求。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，篩選找到合適的檢測(cè)器和色譜系統(tǒng)，方法有足夠的專屬性，能滿足它的目標(biāo)。

臨床研究階段，在藥物完成初步篩選和安全性評(píng)估后，得到官方的批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。這個(gè)階段的分析方法需要有足夠的能力完成化合物鑒別、純度、表征、含量，以及藥物效價(jià)的評(píng)估。該階段分析方法需要有簡(jiǎn)單的驗(yàn)證或者確認(rèn)，以確保方法的專屬性、可靠性、準(zhǔn)確性和精密度。

藥物上市后研究階段，分析方法常常發(fā)生不同實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)轉(zhuǎn)移，因此方法的耐用性在該階段需要重點(diǎn)考察。經(jīng)歷前面臨床研究的穩(wěn)定性考察，分析方法得到進(jìn)一步優(yōu)化，其專屬性和準(zhǔn)確性將得到進(jìn)一步的確認(rèn)，以用于商業(yè)化產(chǎn)品的放行和穩(wěn)定性考察。

分析質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（AQbD，Analytical Quality of Design）

傳統(tǒng)分析方法開(kāi)發(fā)采用的試錯(cuò)法用于單因素單水平的試驗(yàn)，需要不斷摸索、不斷重復(fù)試驗(yàn)，最后幸運(yùn)地找到一個(gè)合適的方法。這種方法開(kāi)發(fā)的模式比較盲目，費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)成本，方法開(kāi)發(fā)時(shí)不會(huì)考慮各參數(shù)的空間，耐用性差，不同實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移時(shí)常出現(xiàn)方法測(cè)試不能重現(xiàn)的現(xiàn)象。

現(xiàn)代分析方法開(kāi)發(fā)是基于分析質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的理念，對(duì)方法進(jìn)行系統(tǒng)性的研究，多因素多水平同時(shí)評(píng)估。利用方法開(kāi)發(fā)工具和統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析與處理，最后得到一個(gè)高性能的方法。這類方法耐用性好，設(shè)計(jì)空間可靠，準(zhǔn)確性高，收集的方法知識(shí)多，使用的生命周期長(zhǎng)，大大節(jié)省人力和時(shí)間成本。

新藥研發(fā)重點(diǎn)關(guān)注藥物的質(zhì)量可控性、安全性和有效性。通過(guò)質(zhì)量源于設(shè)計(jì)和過(guò)程分析等工具，幫助制藥行業(yè)不斷提高藥品研發(fā)的質(zhì)量。ICH Q8、Q9和Q10緊密聯(lián)系，為藥物的開(kāi)發(fā)研究、質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理，以及制藥質(zhì)量體系提供了很好的理論和實(shí)踐指南。ICH Q11為原料藥的合成工藝開(kāi)發(fā)、設(shè)計(jì)和質(zhì)量提供了實(shí)施指南。

相對(duì)于原料藥工藝開(kāi)發(fā)的設(shè)計(jì)，ICH目前還沒(méi)有具體的指南用于指導(dǎo)分析方法開(kāi)發(fā)，在不久的將來(lái)，ICH Q14將為分析方法開(kāi)發(fā)提供實(shí)踐指南，內(nèi)容包含有分析質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的部分，分析行業(yè)人員期待該指南的正式發(fā)布。

相對(duì)于工藝的質(zhì)量源于設(shè)計(jì)過(guò)程，分析方法的開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)流程類似，如圖1。首先找到方法中分析目標(biāo)概況→定義關(guān)鍵質(zhì)量屬性→對(duì)方法進(jìn)行初步的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估→方法優(yōu)化和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)→找到方法的可操作和設(shè)計(jì)區(qū)域→得到方法的控制策略，進(jìn)一步風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估→基于QbD的方法驗(yàn)證→最后進(jìn)行持續(xù)的方法監(jiān)測(cè)。

圖1：分析QbD工具和生命周期

分析方法的QbD手段有三種方式：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和過(guò)程分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是實(shí)踐中較為常用的手段。

在進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，首先對(duì)方法進(jìn)行初步的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，找到影響方法的關(guān)鍵變量參數(shù)，設(shè)計(jì)關(guān)鍵因素不同水平的實(shí)驗(yàn)，得到一系列的數(shù)據(jù)，使用工具軟件導(dǎo)入與處理這些分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行色譜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，建立數(shù)學(xué)模型，最后找到分析方法重要參數(shù)的可設(shè)計(jì)空間。

分析方法開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE，Design of Experiment）

以有關(guān)物質(zhì)HPLC方法為例，它的分析目標(biāo)概況大致包括下面內(nèi)容，如表1：

表1：有關(guān)物質(zhì)HPLC方法通用分析目標(biāo)概況

對(duì)上述的21個(gè)分析目標(biāo)概況進(jìn)行分析，用理論知識(shí)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)找到關(guān)鍵影響因素，減少變量，簡(jiǎn)化數(shù)學(xué)模型。

圖2：影響有關(guān)物質(zhì)分析方法的因素

對(duì)圖2中影響方法開(kāi)發(fā)的四個(gè)因素，進(jìn)行初步的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，得到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中具體的關(guān)鍵影響因素，如表2。

表2：有關(guān)物質(zhì)HPLC方法的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估分析

通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，確認(rèn)影響分析方法選擇性的關(guān)鍵影響因素：流動(dòng)相的pH，有機(jī)溶劑的比例，流速和柱溫。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估確定的影響因素對(duì)方法開(kāi)發(fā)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE, Design of Experiment）。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的一個(gè)分支，通過(guò)計(jì)劃、執(zhí)行和分析，以及解釋一系列控制性的測(cè)試，用于評(píng)估對(duì)工藝參數(shù)的影響因素。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一個(gè)非常有用的數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計(jì)分析工具。

用于篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)工具包括全因子設(shè)計(jì), 部分因子設(shè)計(jì),placket-burmann,混料設(shè)計(jì)和最優(yōu)設(shè)計(jì)等。用于優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括Central composite design, Box Benken和Doehlert等。

分析方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，通過(guò)不同因素不同水平實(shí)驗(yàn)得到的響因值，建立因素與響因值之間的回歸模型關(guān)系。比如對(duì)單因素水平流動(dòng)相pH值的篩選：不同pH值條件下，可以得到不pH條件下化合物之間的分離度，通過(guò)系列的pH值和分離度數(shù)據(jù)，建立pH值和分離度的數(shù)學(xué)回歸模型，從而找到化合物在某pH值條件下的最佳分離度，同時(shí)還可以找到滿足分離要求的pH值空間范圍。

常用的色譜優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件包括，Drylab,ACD ChromManager和ChromSword。

簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)計(jì)為單因素設(shè)計(jì)。比如，篩選方法的pH值，分離度為關(guān)鍵屬性（Rs），三個(gè)水平pH2.9、3.5和4.1。只需要進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，得到的分離數(shù)據(jù)建立單因素三水平的模型，通過(guò)模型找到最佳分離并預(yù)測(cè)pH值。

稍微復(fù)雜一點(diǎn)的分析方法開(kāi)發(fā)，需要對(duì)兩個(gè)因素兩個(gè)水平的考察。比如梯度和溫度，各兩個(gè)水平。需要2*2，4次實(shí)驗(yàn)，建立模型用于預(yù)測(cè)不同梯度和溫度條件下的分離情況，找到兩個(gè)因素的最佳范圍。

再?gòu)?fù)雜一點(diǎn)的方法設(shè)計(jì)，在上面兩因素兩水平的條件下，引入一個(gè)因素pH值，三個(gè)水平，這時(shí)需要2*2*3，12次實(shí)驗(yàn)，建立模型預(yù)測(cè)三個(gè)因素的最佳范圍。

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的色譜工具軟件已經(jīng)發(fā)展的非常強(qiáng)大， 可以建立多因素多水平的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停⒍S、三維、甚至多維的模型圖，預(yù)測(cè)復(fù)雜的成分分離，建立實(shí)驗(yàn)條件的耐用性范圍。

關(guān)于有關(guān)物質(zhì)分析方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)例

選擇方法中的四個(gè)關(guān)鍵方法參數(shù)：梯度程序，柱溫，流動(dòng)相pH，以及有機(jī)相組成及比例，每個(gè)參數(shù)選擇不同個(gè)水平，具體的流程如下圖3：

圖3：方法開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)流程

分析的化合物包括扁桃酸、鄰苯二甲酸、間羥基苯乙酸、異香蘭素、對(duì)乙酰氨基酚、對(duì)羥基苯乙酸、苯甲醇、香蘭素酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲醇及其它未知成分。

實(shí)驗(yàn)條件為梯度程序兩個(gè)水平：30min和90min，色譜柱溫度水平：30攝氏度和60攝氏度，流動(dòng)相水相離子濃度100mM三個(gè)pH水平：2.4、3.0和3.6。流動(dòng)相有機(jī)相組成三個(gè)水平：純乙腈，純甲醇，乙腈：甲醇（50：50）。

梯度程序和溫度兩個(gè)水平，pH值和有機(jī)相比例各三個(gè)水平，共36次實(shí)驗(yàn)，得到36組色譜數(shù)據(jù)，四因素設(shè)計(jì)如圖4。

圖4：分析方法開(kāi)發(fā)：四因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

得到36組數(shù)據(jù)后，使用工具軟件對(duì)數(shù)據(jù)中的色譜峰分析、識(shí)別與標(biāo)記。匹配完成，所有產(chǎn)生的色譜數(shù)據(jù)將自動(dòng)導(dǎo)入工具軟件中，得到分離二維圖（圖5）。每個(gè)圖對(duì)應(yīng)固定的pH值和有機(jī)相，以及梯度和柱溫兩因素模型圖。在各圖中可以找到分離度大于1.5的各因素的空間和范圍。

圖5：梯度與溫度的二維分離回歸模型圖

不同梯度、溫度、pH和有機(jī)相比例的模擬結(jié)果如下表3：

表3：不同有機(jī)相和pH對(duì)應(yīng)的分離度

可以看到，不同pH值，pH3.0分離度最高，pH3.0次之，pH3.6最低；不同有機(jī)相，甲醇分離度最高，混合溶劑次之，乙腈最低。

在pH3.0的條件繼續(xù)優(yōu)化溫度和梯度程序，找到最優(yōu)的梯度和溫度，軟件模擬和真實(shí)實(shí)驗(yàn)色譜分離如下圖6，結(jié)果非常接近：

圖6：優(yōu)化溫度和梯度條件下的預(yù)測(cè)和真實(shí)色譜圖

通過(guò)上面的多因素與多水平的優(yōu)化，能找到多對(duì)關(guān)鍵色譜分離對(duì)，說(shuō)明在分析方法開(kāi)發(fā)時(shí)，尤其是復(fù)雜的有關(guān)物質(zhì)分離，固定一對(duì)分離對(duì)是很難實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)軟件建立分離模型，可以找到多對(duì)分離對(duì)的設(shè)計(jì)空間，如圖7。

圖7：移動(dòng)的關(guān)鍵色譜分離對(duì)

在工具軟件中，可以通過(guò)多因素多水平的實(shí)驗(yàn)，建立三維的模型。上例中在pH3.0條件的三維模型圖，如梯度、溫度和有機(jī)相比例，能夠找到溫度、梯度和有機(jī)相比例三個(gè)因素的色譜分離耐用性范圍，如圖8。

圖8：三因素三維模型圖

通過(guò)建立三維模型圖，對(duì)實(shí)驗(yàn)中實(shí)際產(chǎn)生的各峰保留時(shí)間與模型中預(yù)測(cè)的保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，如表4，兩者的相關(guān)性良好：

表4：在pH3.0,有機(jī)相ACN:MeOH(25:75)，柱溫42攝氏度，梯度120min，條件下各峰保留時(shí)間和模型預(yù)測(cè)的保留時(shí)間

運(yùn)用軟件工具，對(duì)梯度和流速進(jìn)一步的優(yōu)化，最終得到20min內(nèi)實(shí)現(xiàn)14個(gè)組分優(yōu)良分離的條件，如圖9。

圖9：保留時(shí)間的最終優(yōu)化

該實(shí)例充分運(yùn)用分析方法QbD理念，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，大幅減少實(shí)驗(yàn)的次數(shù)，僅用了36次實(shí)驗(yàn)，通過(guò)多因素多水平建立的分離模型，提高色譜分析工作效率，得到的分析方法具有良好的耐用性范圍，最佳分離度，以及適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間。

結(jié)束語(yǔ)

FDA相關(guān)專家認(rèn)為，通過(guò)分析質(zhì)量源于設(shè)計(jì)，可以幫助制藥專業(yè)分析人員更多地了解和理解產(chǎn)品工藝參數(shù)，收集影響產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)的知識(shí)，確認(rèn)產(chǎn)品的工藝和質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)，最終幫助制藥人員用于產(chǎn)品工藝和質(zhì)量持續(xù)性改進(jìn)和生命周期的管理。

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