One Step Cloning是一種快速構建質粒的方法，也被稱為無縫克隆或單步克隆法。其原理是基于重組原理的無縫克隆技術，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依據DNA片段與線性化載體末端的15~25 nt同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術。

 

One Step Cloning常使用商用試劑盒（如Gibson Assembly Kit或者CloneEZ Kit），試劑盒通常包含三種酶：

 

5'外切酶：這種酶從DNA片段的5'端開始降解，產生突出端的單鏈DNA，這些單鏈可以與其他片段的同源序列互補配對；

 

DNA聚合酶：這種酶延伸3'末端，通過利用互補的DNA片段作為模板，填補缺失的核苷酸；

 

DNA連接酶：在聚合酶延伸完成后，連接酶封閉片段之間的磷酸二酯鍵，確保DNA片段連接完整。研究人員在使用前一定要認真閱讀相關說明書并做調整。

 

但其基本實驗步驟類似，主要為：引物設計、目的基因的擴增、PCR產物純化、載體線性化、無縫克隆反應、轉化、篩選陽性克隆、質粒驗證。

 

一、設計引物

 

作為整個質粒構建的程序中，引物的設計是及其重要的一環。研究人員需要準備好感興趣的蛋白基因序列以及載體基因序列，在軟件上（以SnapGene軟件為例）完成引物的設計以及整個構建過程的模擬。

 

1、目的基因的準備

 

目的基因可以來自于NCBI下載，實驗室測序或生物公司合成。本文以人COL6A2基因為例。 

 

2、載體序列的準備

 

本文以pET-28a(+)載體為例。 

3、目的基因PCR引物的設計

 

目的基因PCR引物設計的目的是完成目的基因（COL6A2）的擴增，根據引物設計原則完成擴增引物的設計。

 

4、選擇載體酶切位點

 

在軟件上選擇合適的克隆位點，對載體進行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向PCR擴增完成。

 

本文選擇NcoI以及XhoI兩個位點。

 

 

5、目的基因PCR引物再設計

 

此步驟的目的是將同源臂加入至引物5’端。PCR引物的5’端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18 nt）序列。假如載體為粘性末端，且3’端突出，則引物設計必須包含突出部分；若5’端突出，則引物設計可以包含突出部分，也可以不包含。

 

插入片段正向擴增引物：

 

5’—上游載體末端同源序列+酶切位點（可選）+基因特異性正向擴增序列— 3’

 

插入片段反向擴增引物：

 

3'—基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可選）+下游載體末端同源序列—5’

 

NcoI以及XhoI兩個位點均為5’端突出，引物設計可以包含突出部分，也可以不包含。本文選擇包含，選擇載體上20 bp片段作為同源臂添加至引物5’端。注意下游引物方向。

 

 

 

 

6、軟件模擬載體構建過程

 

點擊軟件“行動”“Gibson Assembly”，選擇“插入片段”

 

 

載體界面選擇“用限制性酶使其線性化”，選擇預先設計的內切酶。

片段選擇我們的目的片段，并選擇“用作PCR模板”，選擇我們前期設計的上下游引物。

 

 

此時可以在產物界面看到組合完成的載體序列，切右下角的“組裝”按鈕激活。

 

 

直接檢查序列或者點擊組裝后檢查序列。序列的檢查主要包括有無堿基缺失，移碼以及有無起始密碼子，序列是否提前終止。

 

綜上，我們在完成引物設計的過程中也完成了整個實驗流程的模擬。此時我們可以合成引物同時將組裝好的圖譜“歷史”欄打開，打印整個流程，撰寫protocol。

 

 

二、目的基因擴增（PCR）

 

使用設計好的引物，通過PCR擴增出目的片段。擴增時應注意使用高保真 DNA聚合酶，避免產生突變。擴增完成后，使用瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物的大小是否正確。

 

三、PCR產物純化

 

1、如果PCR條帶唯一，可直接用PCR產物純化回收試劑盒純化PCR片段。如果PCR條帶不唯一，則應優化反應條件，或跑膠后再切出符合目的條帶大小的膠塊進行膠回收，去除引物和聚合酶等雜質。

 

2、使用超微量紫外分光光度計測得所回收的PCR產物濃度。

 

四、載體線性化

 

載體可通過PCR或者限制性內切酶切割獲得線性化的質粒。若采用PCR擴增線性化載體，同樣需要高保真DNA聚合酶并進行PCR產物純化。

 

五、無縫克隆反應

 

根據各商品試劑盒的不同要求，加入最適使用量的各組份以及片段和線性化載體。重組反應體系配制完成后，用移液槍輕輕吸打混勻各組分，避免產生氣泡；切勿渦旋，避免機械剪切力導致片段斷裂或變性，影響克隆效率。

 

在適當的溫度（一般為50°C）下孵育30分鐘至1小時，完成片段與載體的拼接。

 

六、轉化

 

將無縫克隆反應的產物轉化到感受態細菌中（如DH5α細菌）。

 

七、篩選陽性克隆

 

1.第二天，先于EP管內加入600 μL含有抗生素的LB液體培養基。

 

2.使用10 μL槍頭挑取轉化后涂布在平板的單菌落8-12個接種至EP管的培養基內。

 

3.37℃搖床內培養6-8 h至菌液渾濁后進行菌落PCR。菌液PCR引物一般為載體通用引物（如T7/T7t）。菌落PCR時建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結果。

 

4.核酸電泳驗證所挑選菌落是否符合預期。對符合預期的單菌落菌液挑選出進行接種培養，并提出質粒。

 

八、質粒驗證

 

將所提質粒送測序或酶切驗證。若測序結果正確，則質粒構建完成。

 

九、注意事項

 

1、引物設計

 

引物的同源臂序列長度要適當，通常為15-25 bp，同源臂過短可能影響重組效率，過長則可能影響引物的退火。確保目的片段的引物設計中不會引入錯誤或突變，最好進行二次驗證。

 

2、PCR擴增

 

使用高保真聚合酶，以降低突變率并確保擴增的片段精確。PCR條件的優化非常重要，以確保擴增效率和特異性。

 

3、目的片段和載體的比例

 

目的片段與載體的摩爾比例通常控制在3:1或5:1，以提高重組效率。可以根據以下公式計算目的片段和載體的用量： 

 

 

若載體的用量為50 ng，則片段的用量一般在150-250 ng（按3:1到5:1比例）。

 

過多的載體可能會導致自我連接，而過多的目的片段可能會增加非特異性結合。

 

4、無縫克隆反應體系的優化

 

無縫克隆反應需要特定的溫度和時間條件，建議嚴格按照試劑盒的說明進行操作，反應時間過長可能導致連接產物降解。

 

5、轉化效率

 

感受態細菌的轉化效率會影響克隆產物的最終產量，確保使用高效感受態細菌，通常轉化效率大于108 cfu/µg是合適的。

 

6、細菌培養和篩選

 

如果載體含有抗生素抗性基因，涂布時需要確保培養基中加入適量的抗生素，以保證正確篩選陽性克隆。對于無縫克隆反應，假陽性菌落相對較少，但仍然建議通過菌落PCR或直接測序驗證質粒。

 

7、菌落PCR時建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結果。