摘  要 

腫瘤治療性mRNA疫苗作為一種新型腫瘤治療方式受到廣泛關注，目前多數產品正處于臨床前或臨床研究階段，國內外尚無成熟的產品上市。由于腫瘤治療性mRNA疫苗的靶點特性、作用機制、遞送特征，以及人體與動物免疫系統存在的差異，使得此類產品在非臨床試驗設計和評價中情況更復雜。其中動物模型的選擇不僅是非臨床有效性關注的內容，也是毒性評價的關鍵考慮因素。本文從腫瘤治療性mRNA疫苗產品非臨床試驗設計的角度，根據此類產品自身特點，通過分析、總結已開展臨床產品的非臨床研究，結合相關指導原則，探討此類產品非臨床評價關注的問題。

2019年新型冠狀病毒肺炎暴發以來，全球積極開展疫苗研發工作，mRNA疫苗作為新一代疫苗受到廣泛關注。mRNA疫苗是利用抗原編碼信使RNA，通過特定的遞送系統使細胞攝取并表達編碼的抗原，從而引起體液和細胞介導的免疫反應的疫苗。使用mRNA疫苗技術研發新型治療性腫瘤疫苗，也為腫瘤治療帶來了新的機會。目前已有許多制藥企業已經開展了腫瘤疫苗研發管線，部分產品進入Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗階段。腫瘤疫苗為腫瘤的治療帶來新的突破，也是繼腫瘤化療、放療、細胞免疫治療之后的新型治療方式。國內外腫瘤治療性mRNA產品多處于臨床前或臨床研究階段。臨床進展較快的為Moderna公司的mRNA-4157/V940，由編碼多達34種新抗原的單一合成mRNA分子組成，正在開展與程序性死亡受體-1（PD-1）抑制藥Keytruda聯合治療黑色素瘤的Ⅱb期臨床試驗，結果可見一定的臨床獲益。

腫瘤治療性mRNA疫苗與預防性mRNA疫苗相比，存在給藥間隔縮短、給藥頻率增加或更長的給藥周期等情況，腫瘤治療性疫苗多為細胞免疫激活特異性T細胞殺傷腫瘤，而預防性疫苗多以體液免疫為主，伴隨細胞免疫，免疫反應類型不同。因此對腫瘤治療性mRNA疫苗在概念驗證、組織分布、安全性研究及新輔料的研究與預防性mRNA疫苗存在一定差異。腫瘤治療性mRNA疫苗產品非臨床研究可參考的相關的指導原則有國家藥品監督管理局于2021年12月發布的《基因治療產品非臨床研究與評價技術指導原則》，ICH S12《基因治療產品非臨床生物分布考慮》。本文通過分析已開展臨床產品的非臨床研究，結合相關指導原則，探討此類產品非臨床評價關注的問題。

1、 受試物

非臨床研究用受試物應能代表臨床擬用樣品，原則上應考慮生產工藝流程、關鍵質量特征及臨床擬用制劑等因素。若非臨床樣品輔料、生產工藝、生產場地等發生變更，應進行質量對比研究，評估工藝變更對本品有效性及安全性的影響，必要時應開展非臨床橋接研究，以提供產品的有效性和安全性的支持信息。

2、 有效性

2.1   概念驗證研究

對于腫瘤治療性mRNA概念驗證一般包括體外和體內研究。體外應進行抗原表達、特異性T細胞激活或特異性腫瘤細胞殺傷等試驗，評估受試物生物學活性及對作用機制的初步驗證。體內研究主要為在相關動物模型上驗證抗腫瘤活性獲得最低起效劑量，伴隨檢測特異性免疫T細胞表型、細胞因子等免疫相關指標，進一步驗證本品有效性及作用機制。體內有效性研究應為臨床給藥途徑、給藥頻率提供支持性依據，為臨床起始劑量選擇提供參考。

對于一些mRNA產品，嚙齒類動物（大鼠、小鼠）和非人靈長類動物可能為非相關動物種屬，因此在開展非臨床研究時可能采用動物源基因樣品進行試驗。替代產品應有與臨床擬用樣品相似的目的抗原表達、抗原遞呈、免疫系統特異性激活等作用。如：在目標靶細胞中考查人源與鼠源產品的細胞轉染率及抗原表達量；動物體內試驗考查動物源產品激活T細胞的能力。對于編碼個性化腫瘤新生抗原的mRNA疫苗，如果無相關動物種屬，替代產品可選擇動物源腫瘤相關的抗原進行編碼。對于采用動物源替代產品開展體內有效性研究僅能在一定程度上評價遞送系統的遞送效果，不能提示抗原序列的抗腫瘤有效性特征。對于無相關動物種屬而選用替代產品開展體內有效性研究的產品，其體外功能活性及抗腫瘤作用是提示產品有效性的關鍵信息。

基于腫瘤適應證復雜的免疫抑制機制，聯合治療是克服這一問題的關鍵，常見的聯合策略有放化療與免疫治療聯合、靶向治療與免疫治療聯合等。對于mRNA治療性疫苗，如擬開展聯合給藥臨床試驗，建議應先在非臨床中驗證聯合用藥帶來的獲益與風險，為臨床聯合用藥提供合理性依據。

2.2 動物種屬/模型

選擇相關的動物種屬/模型是開展體內有效性試驗的前提。相關動物種屬選擇應考慮動物對表達抗原的免疫原性、藥理作用等，如受試物在動物體內表達的抗原不能引起特異性免疫反應，則可能不是相關動物種屬。腫瘤動物模型選擇，應根據擬申請適應證（血液瘤或實體瘤）、目的抗原表達情況建立合適的荷瘤模型，可以是鼠源腫瘤模型或人源化小鼠荷瘤（人源腫瘤）模型。如對于編碼免疫刺激的產品，可以建立免疫系統人源化小鼠異種移植瘤模型，考查其在體內刺激免疫系統發揮抗腫瘤作用機制。

3、 藥代動力學

mRNA產品通常需開展體內分布試驗，應采用合適的動物種屬或模型，選擇臨床擬用給藥途徑，給予足夠的劑量開展，通常采用熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）方法考查其在體內靶組織及非靶組織的分布和清除，可選擇在腫瘤模型動物中開展分布研究。組織分布取樣時間點應能說明藥物在體內的復制特征，至少包括峰值和清除階段。替代產品的生物分布試驗可能不足以反映臨床用樣品的生物分布特征，一般建議在合適的動物模型中進行臨床樣品生物分布研究。

4、 安全性

一般毒理學試驗用于評估藥物毒性特征、毒性反應可逆性、延遲毒性及劑量-毒性關系等，是新藥申請臨床試驗的關鍵安全性試驗，包括單次給藥毒性試驗和重復給藥毒性試驗。一般毒理學試驗設計應關注動物種屬選擇、劑量設置、給藥周期、給藥頻率、動物數量、對照選擇等問題。動物種屬一般選擇健康動物，但在無相關動物種屬時，可選擇腫瘤模型動物開展毒理研究，如人免疫系統重建荷人源腫瘤模型等。根據產品特點在至少一種動物種屬中開展毒理試驗。重復給藥毒性試驗應獲得劑量-毒性反應關系，選擇合適的給藥途徑、給藥頻率及周期為臨床試驗方案提供支持性依據。安全性研究除常規指標考察外，還應關注免疫反應引起的安全性擔憂，對含脂質納米粒（LNP）等遞送系統的產品應關注與遞送系統相關的毒性。

對于無相關動物種屬的產品，且人源化重建動物模型因模型原因死亡較多無法評價等情況，可考慮使用替代產品。替代產品的毒理學試驗在反映產品安全性信息方面具有局限性，在于其可能與臨床擬用樣品存在質量屬性、組織分布、作用機制等差異，不能全面提示臨床安全性風險及不能支持臨床起始劑量擬定，僅作為安全性評價的參考。

安全藥理學是評價產品對生理功能的潛在不良影響，一般包括心血管、呼吸和中樞神經系統。一般來說，對于mRNA疫苗類產品安全藥理學試驗可單獨開展，也可結合在一般毒性試驗中考查。如結合在一般毒性試驗中，應關注數據采集時間及檢測指標。免疫原性、免疫毒性、局部刺激性等安全性試驗也可結合重復給藥毒性試驗進行考察。

腫瘤治療性mRNA疫苗生殖毒性、致癌性試驗可參考ICH S6《生物制品的臨床前安全性評價》、ICH S9《抗腫瘤藥物非臨床評價》等指導原則的相關建議。對于無法采用正常動物開展生殖毒性研究的產品，可根據其作用特點、一般毒理發現、生物分布等信息綜合評估生殖毒性風險。

5、 新輔料

LNP是目前常用的遞送系統，制備LNP的脂質成分、緩沖體系及相關成分可能影響顆粒整體質量特性及有效性、安全性。因此，對于使用新脂質成分或工藝重大變更的LNP，需對LNP進行非臨床安全性研究。如含新陽離子脂質的LNP，應對其新陽離子脂質成分或LNP進行遺傳毒性研究，對LNP可伴隨疫苗或單獨開展必要的安全藥理及一般毒理試驗。

6、 討論

腫瘤治療性mRNA疫苗作為一種新的腫瘤治療手段，雖然臨床試驗正在積極開展，但總體仍處于開發初期。對于此類產品的非臨床試驗方法、試驗設計也處于不斷探索的階段，非臨床設計整體考慮也與其表達抗原、遞送載體等特性密切相關。

腫瘤治療性疫苗根據編碼產物可分為mRNA編碼免疫刺激劑、腫瘤相關抗原(TAA)、新抗原3種。①免疫刺激劑主要通過受體介導發送的信號調節免疫反應的質量，可作為mRNA疫苗的編碼抗原增強機體的抗腫瘤免疫，常與其他免疫治療藥物共同使用，可編碼細胞因子包括白細胞介素-2（IL-2）、IL-23、IL-12、IL-15等。②mRNA編碼TAA是目前最常用的靶向抗原，將TAA作為抗原進行編碼，從而達到對腫瘤細胞的靶向識別與殺傷效果。然而，其局限性在于TAA在正常組織細胞中也有表達，可能會引發免疫耐受或脫靶效應；且TAA具有變異性，易發生免疫逃逸和耐藥。③mRNA編碼新抗原作為個性化治療。新抗原（neoantigen）廣義上是指由腫瘤細胞的突變基因所編碼產生的，能被機體免疫細胞所識別，并激活免疫應答的一類異常表達的蛋白質。新抗原疫苗是由非沉默體細胞突變產生的具有腫瘤特異性表達的 T 細胞表位，具有高免疫原性、個體化特性，在正常組織中不表達。接種新抗原疫苗既可以擴大已有的新抗原特異性 T 細胞群，又可以在癌癥患者中誘導更廣泛的新特異性T細胞，從而發揮抗腫瘤效應 。

mRNA帶有負電荷，在體內遞送需要穿越雙層脂膜跨膜負電位的屏障；在細胞質內，外源mRNA也存在著被核糖核酸酶降解的風險。mRNA腫瘤疫苗的傳統遞送方式包括病毒載體、體外負載DC等，而目前使用更廣泛的為納米脂質材料載體。DC作為最強大的抗原提呈細胞，除誘導CD4+ T細胞免疫應答以外，可將外源性抗原經MHC-Ⅰ途徑交叉提呈，誘導CD8+ T細胞的免疫應答。不足之處在于制備過程相對復雜，且易受到腫瘤異質性和腫瘤抗原靶標選擇的影響。LNP是目前轉染效率較高的遞送系統，LNP 脂質殼結構主要由膽固醇、中性磷脂、聚乙二醇 (PEG)-脂質和可電離陽離子脂質組成，膽固醇穩定 LNP中性磷脂支持脂質雙層結構并有助于溶酶體逃逸，PEG-脂質能延長疫苗的半衰期防止顆粒聚集，可電離脂質在酸性條件下帶正電，通過靜電作用吸附負電性的 mRNA 形成復合物，是 mRNA 遞送和轉染效率的決定性因素。

藥物的非臨床評價對藥物的開發、使用具有重要的指導意義。腫瘤治療性mRNA疫苗作為一種創新性治療手段，研發中涉及的抗原選擇、概念驗證、安全性評價、遞送系統都需經過充分地研究，才能在腫瘤免疫治療方面取得突破。本文通過整理對腫瘤治療性mRNA疫苗非臨床評價的一般性問題考慮，梳理審評中常見問題，以期為腫瘤治療性mRNA疫苗的研發提供參考。