保證藥品安全、有效、質量可控是藥物研發和評價應遵循的基礎原則。對藥品進行質量控制是保證藥品安全有效的基礎和前提。為達到控制質量的目的，需要多角度、多層面來控制藥品質量，也就是說要對藥物進行多個項目測試，來全面考察藥品質量。一般地，每一測試項目可選用不同的分析方法，為使測試結果準確、可靠，必須對所采用的分析方法的科學性、準確性和可行性進行驗證，以充分表明分析方法符合測試項目的目的和要求，這就是通常所說的對方法進行驗證。

方法驗證的目的是判斷采用的分析方法是否科學、合理，是否能有效控制藥品的內在質量。從本質上講，方法驗證就是根據檢測項目的要求，預先設置一定的驗證內容，并通過設計合理的試驗來驗證所采用的分析方法能否符合檢測項目的要求。

方法學驗證的內容-檢出限和定量限

檢測限和定量限是分析方法的重要屬性，在中國藥典2020年版分析方法驗證指導原則中規定這2項是重要的驗證指標，定量分析需考慮定量限；限度分析需測定檢測限，且在該版本指導原則中刪除了校正因子以及其中定量限的規定。

根據ICH Q2 以及各國藥典方法學驗證內容一般需要評價的典型驗證項目有: 專屬性、準確度、精密度( 重復性和中間精密度) 、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性等。根據分析方法的類型不同，需要驗證的項目不同，見表1。

定義

檢測限（Limit of Detection，LOD）：系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據，沒有定量意義。因此需要注意的是在檢出限附近不能進行準確的定量，且報告未檢出時應附上方法的檢測限。

檢測限的測定是通過對一系列已知濃度被測物的試樣進行分析，并以能準確、可靠檢測被測物的最小量或最低濃度來建立。

定量限（Limit of Quantitation，LOQ）：系指試樣中被測物能被定量測定的最低量。其測定結果應具有一定的準確度和精密度。

定量限體現了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。雜質定量試驗，需考察方法的定量限，以保證含量很少的雜質能夠被準確測出。

另外需要注意的是：

•定量限/檢測限有些地方會翻譯為Quantitation limit，QL和Detection Limit，DL，這個根據各個公司自己規定執行即可。

檢測限和定量限的測量方法

指導原則中規定了三種方法測定檢測限和定量限：

（1）直觀法：用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢出（或定量測定）的最低濃度或量。

對于目測法而言，需要提供逐級稀釋的圖譜，并說明稀釋過程。如下圖采用采用初始濃度0.4ng/ml逐級稀釋，最后目測觀察0.10ng/ml的濃度相當于檢測限濃度。

（2）信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即將已知低濃度試樣檢出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地檢出（或定量）的被測物質最低濃度或量。一般以信噪比3:1或2:1時（或10:1）相應濃度或注入儀器的量確定檢測限（或定量限）。

（3）基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法。按照LOD=3.3δ/S或LOQ=10δ/S公式計算，式中LOD為檢測限，LOQ為定量限，δ為響應值的偏差，S為標準曲線的斜率。其中δ可以通過以下方法獲得：①測定空白值的標準偏差；②采用標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差來代替。

方法學驗證中，應在申報資料中說明是采用上述何種方法來測定檢測限或定量限的。

檢測限和定量限的常見問題

檢測限和定量限常采用信噪比法測定。該計算方法下的檢測限與定量限是通過對照品逐級稀釋的方法獲得的，沒有考慮任何樣品制備步驟的影響，因此其值往往比分析方法本身的實際檢測限與定量限低，而且每臺儀器也不一樣，因此信噪比法是用來考察儀器本身性能的，與方法本身的檢測限或定量限還是不一樣的。信噪比法受到的影響因素比較多，例如所用色譜柱的柱效、檢測器的氘燈壽命等。例如，下圖中峰形尖銳的信噪比高，s/n=11，此時檢測限和定量限都較低。

盡管信噪比法有諸多問題，但目前仍是方法學驗證中最常用的計算方法。從目前國內提交的申報資料來看，檢測限和定量限評價一般采用信噪比的方法來確定，存在問題較小，有時，為了保證方法的靈敏度，有時可采用靈敏度較好的PDA/DAD檢測器進行檢測限和定量限的考察。

通常檢測限應低于限度的1/30，定量限應低于限度的1/10，如果達不到這一要求，可適當放寬，只要規定定量限應比ICH規定的雜質的報告限低即可（例如50%報告限）。

由于靈敏度受儀器、色譜柱、試劑、泵系統、檢測器等的影響很大，因此為了保證方法的檢測能力，有些藥物的質量標準中規定了靈敏度溶液的信噪比作為系統適用性要求來考察整個色譜系統的靈敏度，相信這種方法以后會應用越來越多。

在指導原則中還有一句話很重要：“上述方法獲得的檢測限和定量限數據須用含量相近的樣品進行驗證，應附測試圖譜，說明測試過程和定量限結果，包括準確度和精密度驗證數據。”

如何進行檢測限和定量限的驗證呢？常見的做法是采用雜質加標的方法進行驗證，例如在供試品溶液中加入相當于檢測限或定量限濃度的雜質，考察加入后的色譜圖中信噪比是否符合要求。定量限的精密度驗證目前基本都做到了，常采用配制6份定量限濃度的溶液，所測6份溶液雜質峰保留時間的相對標準差應不大于2.0%，峰面積的相對標準差應不大于5.0%的方法進行評價。有時也進行定量限濃度的準確度驗證，可接受限度可參考上述準確度項下的規定，有時也可以適當放寬。

對于滴定方法而言，不必驗證方法的檢測限和定量限，而應更重視方法的準確性、精密度和專屬性。

參考文獻

[1] 中國藥典2020年版通則9101分析方法驗證指導原則（第二次征求意見稿）

[2]梅希，2020版藥典9101<分析方法驗證指導原則>要點淺析：藥事縱橫

[23]李飛1，李云2：對藥物研發中分析方法驗證的幾點考慮，中國新藥雜志 2021.05