1、不同藥典中不溶性微粒檢測的歷史發展

1.1 中國藥典

1985年版《中華人民共和國藥典》收錄了100 mL以上大容量注射液的不溶性微粒檢測（顯微計數法）；2000年版《中華人民共和國藥典》增加了光阻法作為不溶性微粒檢測的第二法；2005年版《中華人民共和國藥典》將光阻法由第二法改成第一法，并增加100 mL以下小容量注射液劑型的檢測方法；2010年版《中華人民共和國藥典》通則<0903>更新，光阻法和顯微計數法的檢測限度標準與美、日、歐藥典基本一致；2015年版《中華人民共和國藥典》增加了用于無菌粉末、無菌原料藥、注射用濃溶液的檢測方法；2020年版《中華人民共和國藥典》通則<0903>內容與2015年版內容保持一致。

1.2 美國藥典

1975年美國藥典（USP）采用顯微計數法檢測評估100 mL以上大容量注射劑中不溶性微粒；1985年增加光阻法為第二法并對100 mL及以下的小容量注射液劑型檢測方法作了要求；1995年USP 23<788>將光阻法改為第一法，顯微計數法作為第二法，并對判定標準進行了修改且沿用至今；2017年USP 40<1788>收錄不溶性微粒檢測第三法——動態（流動）圖像法（Flow Imaging Method,FI），但FI作為新興技術，缺乏歷史數據，難以建立統一的規范，至今仍未被收錄至通則<788> 中。

1.3 歐洲藥典和日本藥典

對比歐洲藥典5.0版（EP 5.0）和歐洲藥典10.0版（EP 10.0）及日本藥典15版（JP 15）和日本藥典18版（JP 18），發現歐洲藥典和日本藥典不溶性微粒檢測方法相關章節在近年來無明顯變化。但是EP 11.0<2.9.19>章節中內容相較于EP 10.0增加了生物技術藥物不溶性微粒檢測相關內容。

2、不同藥典中不溶性微粒要求比較

自2010年起，《中華人民共和國藥典》2010年版對不溶性微粒的要求與美國藥典（USP 32）、日本藥典（JP 15）、歐洲藥典（EP 6.0）已基本保持一致，但在具體檢測方法上仍存在部分差異。此外，美國藥典中不溶性微粒檢測除了注射劑通用的USP<788>章節外，還專門針對治療性蛋白注射劑（USP<787>）和眼用制劑（USP<789>）單設章節，要求更加清晰。JP 18也針對治療性蛋白注射液單設章節<6.17>，而在《中華人民共和國藥典》2020年版中卻未見區分。以下將從ChP 2020、USP-NF 2023、EP 11.0、JP 18中注射劑不溶性微粒要求的通用章節的檢測方法、質量標準、系統適用性要求三個方面進行比較論述。

2.1 檢測方法的對比

不同藥典推薦的不溶性微粒檢測方法均為光阻法與顯微計數法，但在檢測涉及的試驗環境、檢查用溶劑和具體的樣品檢測要求上，中國藥典與美、歐、日藥典存在差異。

2.1.1 對試驗環境和檢查用溶劑的要求

為了盡可能減小外來顆粒對樣品檢測結果的影響，各國藥典除了對測試環境和檢查用溶劑提出要求外，還要求在檢查前進行檢測。USP-NF 2023明確了該檢測的目的是確認測試環境、玻璃器皿、微粒檢測用水等是否滿足試驗要求，且該檢測可重復進行直至結果滿足要求后才可進行后續試驗。對比來看，美國藥典對于檢查用注射用水的要求較高，具體見表1。

2.1.2 樣品檢測要求

在具體的樣品檢測要求方面，不同藥典在相同供試品規格下的供試品數量、檢測次數、檢測體積有所不同。此外，USP-NF 2023<788>要求對于大容量注射劑，應對單個用藥單元進行測試，而這一點在Chp 2020通則<0903>中并未明確。且在FDA官網的GMP問答中，也表示不接受測試單元之間的結果進行平均，因為顆粒物質在整個批次中可能是不均勻地分散的，評估每個單獨單元的結果的目的是確保代表性并檢測批次內的潛在變化。

美、歐、日藥典就不溶性微粒檢測相關內容已達成一致，不會單方面作出修改。通過與中國藥典內容對比可見，無論是光阻法還是顯微計數法，在對于不同規格的供試品，其供試品數量和檢測次數要求上，美、歐、日藥典要求與中國藥典差異較大，尤其是在對25 mL以下的供試品檢測方面。美、歐、日藥典要求更側重在對25 mL以下的供試品檢測要求的限定，其檢測要求也更為詳細和嚴苛。兩種方式各有優劣，比如采用美、歐、日藥典的檢測方法時，供試品數量要求多，測試覆蓋的樣品體積大，檢測得到的數據也更具批代表性；而且，光阻法檢測時，對于儀器是否具備微量進樣功能的依賴度更低。但是，對于單瓶貨值比較高的小容量規格的供試品而言，測試時供試品用量大，檢測成本較高，而且雖整體樣品量大而更具代表性，但也在一定程度上平均了各個供試品的品質差異，弱化了在實際應用過程中單瓶供試品間的差異。采用中國藥典的檢測方法，則可以降低企業的檢測成本，并更有利于監測單個供試品內不溶性微粒水平的波動。

此外，Chp 2020還明確了靜脈注射用無菌粉末和供注射用無菌原料藥的測試方法，而USP-NF2023中僅提到了粉末的溶解方法。光阻法檢查方法對比見表2、表3，顯微計數法檢查方法見表4、表5。

2.2 質量標準的對比

2.2.1 方法優先級比較

不同藥典均將光阻法作為檢測方法的第一法，顯微計數法作為第二法。美國藥典、日本藥典、歐洲藥典均明確說明光阻法優先，中國藥典并未明確提及，且在描述不適合光阻法檢測的特殊樣品時，表述中出現了顯微計數法測定結果有效性略優于光阻法的描述：“當光阻法測定結果不符合規定或供試品不適于用光阻法測定時，應采用顯微計數法進行測定，并以顯微計數法的測定結果作為判定標準。”美國藥典、日本藥典、歐洲藥典也提到“供試品不適于光阻法時可以采用顯微計數法”，但并未出現“以顯微計數法的測定結果作為判定標準”這一表述。在美、日、歐藥典中，當出現光阻法和顯微計數法都可采用的情況時，并未明確說明以哪一個方法為準，而是希望得到一個一致（Conformance）的結論。

2.2.2 限定標準比較

在大體積和小體積的分類中，中國藥典、日本藥典將100 mL規定為大體積，美國藥典和歐洲藥典則將100 mL規定為小體積，除此之外，各藥典對于大容量注射劑和小容量注射劑的限定標準一致，具體見表6。

但是在ICH Q4B附錄3(R1)中，對于100 mL注射劑，歐盟和FDA均認為美、日、歐三方藥典的判定標準均有同等效力。因此，中、美、日、歐在對注射液中不溶性微粒數的限定標準方面要求一致。

2.3 系統適用性檢測的對比

系統適用性是在檢測樣品之前，用來確認測量系統的重復性和準確性是否能夠滿足當前分析的要求，測試基于的原則：整個測量系統是由儀器、電路、分析方法和樣品所組成的，將其作為整體去測試，從而驗證整個系統的狀態。藥典中對不溶性微粒檢測的系統適用性描述不涉及分析方法和樣品，只對儀器進行系統適用性要求（使用標準樣品對儀器進行校驗），因此本節對藥典中系統適用性的對比只涉及了儀器部分。

中、美、日藥典均介紹了不溶性微粒測試方法的系統適用性標準，歐洲藥典僅介紹了不溶性微粒測試方法，未見系統適用性要求相關內容。中國藥典和日本藥典將測試方法、限定標準、系統適用性都放在同一章節，分別對應2020年版《中華人民共和國藥典》通則<0903>和JP 18<6.07>,USP-NF 2023則將測試方法和限定標準放在<788>中，而系統適用性測試標準則在<1788>、<1788.1>、<1788.2>中均有描述。

2.3.1 光阻法

歐洲藥典并未對光阻法的系統適用性進行較多描述，中國藥典、美國藥典、日本藥典在系統適用性檢測上的不同之處主要為檢測項目的差異，詳見表7。

(1）在儀器的校準頻次方面，中國藥典明確至少每6個月校準一次，日本藥典明確至少每一年校準一次，美國藥典雖未明確校準頻次，但是提出應在使用前或日常進行足夠頻次的性能確認，以驗證儀器在制造商的規格和預期用途范圍內提供準確、一致的結果。

(2）在體積準確性的驗證方面，美國藥典僅驗證2次結果的準確性，未考慮此項重復性的驗證。中國藥典則驗證3次測試準確性，其對體積準確性的要求更高。

(3）相對于中國藥典，美國藥典和日本藥典對流速和直徑校準提出了要求，檢測項更為詳細及嚴苛。事實上，基于光阻法原理，將流速作為系統適用性確認項有利于測試過程更準確。而且對于光阻類傳感器而言，不同流速下的校準曲線結果是有差異的。對于用于曲線校準的粒子的大小，美國藥典和日本藥典也有所不同，美國藥典中對于標準粒子的選擇進行了說明，比如10μm和25μm是標準檢測要求，增加5μm和15μm的校準是為了確保測試結果準確可靠。

(4）中、美、日藥典在對微粒計數的測定方法與標準上均有不同。中國藥典要求計數誤差在20%以內，而美國藥典要求計數誤差在10%左右，計數準確性要求更高，且針對不同類型的設備，作了3種方法區分，充分考慮不同設備的驗證能力。且在實踐操作中，美國USP官方商城中出售的Particle Count Set中將計數準確性設定了兩個范圍值，一個是顆粒數量的范圍值，另一個是粒徑15μm和10μm的顆粒數量比值，且經過計算，誤差范圍約在±10%。

(5）在對傳感器分辨率的要求上，中國藥典和美國藥典對粒子大小分辨率測試方法的描述較為全面，日本藥典和美國藥典的檢查方法和要求一致，但計算方法略有不同。對比而言，美國藥典所述的計算公式更科學，更能反饋傳感器的分辨率性能。

2.3.2 顯微計數法

對于顯微計數法的系統適用性檢測，日、歐藥典內容一致，且所涉及的項目在美國藥典均有包含。美國藥典所含內容最為詳實，中國藥典在項目要求上相對較少，詳見表8。

美國藥典認為顯微鏡的光學對準和照片是顯微計數法成功的關鍵，且顯微鏡對準不良也會造成操作者的疲勞。由于衍射極限約為1μm，在次優照明、干擾背景、粒子特征等多因素影響下，可能很難區分9μm和10μm或24μm和25μm。而操作員必須確認一個粒子是否高于或低于極限，因此優化檢測系統的分辨率十分重要，基于操作者和保證測定數據的準確性考慮，美國藥典對顯微鏡、照明器、閾值靈敏度、微粒計數和直徑校驗（機器自動計數儀器）、微粒計數和直徑校驗（手動計數儀器）均作了詳細的要求。且美國藥典要求，當該粒子粒徑結果處于極限，不確定是否應當被計數時，操作員應當將其計數，且應對主要的粒子形態進行描述，適時做進一步分析。

在對微孔濾膜的要求上，中國藥典明確了孔徑為0.45μm，美國藥典則是給出了孔徑范圍（孔徑為1.0μm或更細），給予操作者一定的選擇空間，且在<1788.2>章節中對此進行了說明，即“更細的孔徑膜有更光滑的表面，提高了顆粒在顯微鏡下的分辨率，但較小的孔徑可能會阻礙實驗過程中黏性樣品液的過濾”。

3、對于生物技術藥物中不溶性微粒的監管考慮

3.1 藥典要求

目前，ChP 2020對于不溶性微粒的要求僅有通則0903，通過對ChP 2020三部收載的治療性蛋白品種進行匯總，發現此類品種的不溶性微粒限度也僅要求符合通則0903，未見針對生物技術藥物特性提出不溶性微粒要求。而USP-NF 2023、EP 11.0、JP 18則均收載了生物技術藥物中不溶性微粒相關的檢測方法和要求。如USP-NF 2023和JP 18針對該類產品的特性，為治療性蛋白注射液不溶性微粒單獨制定了通則；EP 11.0雖未單設章節，但相較于上一版，在內容中也增加了生物技術藥物適用的部分，具體內容如下：

(1）在檢測方法方面，USP-NF 2023<787>章提到應首選光阻法，但同時也提到在充分研究的基礎上，其他監管可接受的方法及限度要求也是可以被接受的。顯微計數法則在非蛋白粒子或重要的粒子特征檢查時會用到。在JP 18<6.17>章節中則明確檢查方法為光阻法，并未提及顯微計數法。EP 11.0<2.9.19>則提到光阻法和顯微計數法均可適用。另外，USP-NF 2023、EP 11.0、JP 18均提出，應用光阻法檢測時，超聲處理作為常用的除氣泡的方式并不適用，因為超聲可能會導致蛋白的聚集或變性而影響檢測結果。

(2）在檢測用樣品方面，USP-NF 2023<787>章節指出，若企業全面考慮到使用較小的檢測產品體積可能涉及的分析相關的問題，在提供相關說明的情況下，允許使用較小的檢測產品體積和較小的檢測等分來進行檢測，單次檢測所需的體積通常為0.2～5.0 mL。在JP 18<6.17>中也明確樣品檢測體積可以減低為1 mL至5 mL，在滿足一定條件下，甚至可以降至0.2 mL。而EP 11.0<2.9.19>僅說明在儀器適用的情況下，可將檢測體積定為1 mL至5 mL。USP-NF 2023、EP 11.0、JP 18均認可若可以從一個容器中獲得測試所需的體積，則對單個容器進行測試；若單個容器中的體積不能滿足測試需求，可將多個容器中的內容物混合；但均未對混合樣品的數量進行規定。與表2要求相比，這充分考慮到該類產品的容量較小的規格特征[18]和檢測成本。

(3）在限度要求上，均仍僅對粒徑為10μm和25μm及以上的粒子進行計數，JP 18<6.17>和EP 11.0<2.9.19>中的限度要求與表6一致。USP-NF2023<787>雖對治療性蛋白注射劑中不溶性微粒提出了要求，但也僅在通用章節<788>要求的基礎上，對于大容量注射劑（>100 mL）增加了單個供試品容器總微粒負載量的要求，即對于粒徑在10μm及10μm以上微粒，數量應≤6000粒/容器；對于25μm及25μm以上微粒，數量應≤600粒/容器；在<1787>章節中提供了對產品中2～10μm粒徑粒子計數和區分粒子類型的檢測方法，以便在進行此類產品不溶性微粒檢測時可以進行更小粒徑范圍的粒子監測。

但是，對有免疫原風險的小粒徑（0.1～10μm）不溶性蛋白聚集體微粒，均未提出明確要求或指導性建議以控制其可能帶來的免疫原性危害。

3.2 指導原則等相關要求

FDA在2014年發布的《行業指南：治療性蛋白制品免疫原性的評估》（Guidance for IndustryImmunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products）指出，蛋白質聚集形成的顆粒可能會引起或增強免疫反應[19]，形成的高分子聚合蛋白是可能造成免疫反應的主要物質。此外，0.1～10μm大小范圍內的微粒也具有很強的免疫原性潛力。因此，FDA建議企業應在研發過程中盡可能采取措施減少蛋白質聚集，在產品檢測中也需要采用單獨或聯合增強蛋白聚集體檢測的方法來表征產品中不同種類的聚合物。FDA在該文件中還指出，企業應評估治療性蛋白產品在整個保質期過程中（包括最初樣品）存在的亞可見顆粒（2～10μm）的范圍和水平。隨著科技的發展和更多檢測方法的出現，企業應努力在更小的尺寸范圍內（0.1～2μm）對產品中的粒子進行表征。根據USP-NF 2023<1787>的描述，這里應當包括粒子的類型、粒徑范圍及不同粒徑粒子的數量水平等內容。

經查詢日本藥品醫療器械管理局（Pharmaceuticals and Medical Devices Agency,PMDA）、歐洲藥品管理局（The European Medicines Agency,EMA）和我國國家藥品監督管理局相關官網，PMDA于2023年3月在官網發布草案《生物技術產品（生物制藥）原料藥、藥品中不溶性顆粒物的流動成像法評價方法》[Evaluation Method of Insoluble Particulate Matter in Biotechnological Products (Biopharmaceuticals) Drug Substances/Drug Products by Flow Imaging Method〈G3-17-182〉]，該草案提及了對于蛋白聚集體帶來的免疫原性，應對其進行嚴格的評估和控制，但是該方法的測量范圍仍為2～100μm。國家藥品監督管理局藥品審評中心于2022年5月發布的《特異性人免疫球蛋白藥學研究與評價技術指導原則》對于不溶性微?？刂埔矁H提出“特免制品尤其是靜注特免制品，還需重點關注對不溶性微粒的控制。”對于蛋白聚集體僅提出“特免制品制備過程中產生的多聚體與抗補體活性（ACA）有關，應重點控制免疫球蛋白G(IgG）多聚體含量。”未見對于多聚體的含量和小粒徑不溶性蛋白聚集體顆粒相關標準和指導原則。

4、建議

對于治療性蛋白注射液中不溶性微粒，雖然FDA發布行業指南建議評估治療性蛋白產品中小粒徑（0.1～10μm）的不溶性微粒，但是該行業指南并非強制要求。所以，對于產品中不溶性微粒，目前主要依靠企業的風險防控手段進行控制，企業在進行充分的研究和有足夠的數據支持的基礎上，明確在新增的不溶性微粒不影響產品本身質量的前提下，采取終端過濾的方式除去；如抗EGFR全人源單抗注射液，其進口原研藥（帕尼單抗）和國內生物類似藥注射前都要進行濾器過濾?？墒?，這并未從根本上解決問題，還是需要研發者秉著質量源于設計（QbD）的理念在藥物的研發設計時，關注到產品中的小粒徑不溶性微粒，通過制定有效的措施，減少不溶性微粒的產生以降低或消除風險。

小粒徑（0.1～10μm）蛋白聚集體通過靜脈注射進入患者體內可能引發的免疫原性的風險日益受到關注，可是目前仍按照藥典通則要求對10μm及10μm以上的粒子進行質量控制。為更好地控制生物技術藥物中小粒徑（0.1～10μm）蛋白聚集體可能帶來的免疫原性風險，保障患者的用藥安全，提出以下三點建議：

(1）方法學研究方面：建議應使用多種方法檢測注射液中小粒徑不溶性微粒，進行全面的表征和對比性研究以獲得準確的數據。此外，產品中“固有顆粒”的形成是一個動態、持續的過程，建議可分兩個階段對產品中小粒徑微粒進行監測。先建立快速檢測方法，準確識別產品中小粒徑（0.1～10μm）不溶性微粒的增長情況；再根據需要對產品中不溶性微粒進行鑒定和分類，以充分了解產品的質量情況。

(2）數據收集方面：建議持續收集產品中小粒徑不溶性微粒數據，包括臨床試驗樣品、穩定性考察樣品及上市后的貨架期內的樣品，結合不良反應情況對數據進行分析。

(3）技術要求方面：建議在可能涉及此類風險的生物技術藥物藥學研究指導原則中明確對初始樣品和穩定性樣品中0.1～10μm小粒徑不溶性微粒數據的收集，以引導企業關注，盡可能在研發階段找到合理的措施降低風險。

編者按：

綜上所述，不同藥典中不溶性微粒檢測方法經歷了不斷的發展和完善。未來，隨著科技的進步和醫藥行業的發展，不溶性微粒檢測將面臨新的挑戰和機遇。我們需要繼續加強研究和合作，不斷完善和優化不溶性微粒檢測方法，以確保注射劑的安全性和有效性。