多肽類藥物安全性評價是缺少特定指導原則的。ICH M3（R2）更多是針對小分子，ICH S6（R1）則適用于大分子。多肽藥物分子量介于兩者之間，制備方式既有化學合成，也有發酵所得。選擇1998-2019年間FDA批準的46個多肽藥物進行分析，其中21個是化學合成的、6個半合成、18個重組表達、1個是天然產品。其中，5個BLA上市，41個NDA上市。本文就多肽類藥物一般毒理研究、遺傳毒性研究、免疫原性測定、生殖和發育毒性、雜質、安全藥理測定、非蛋白原性氨基酸等相關內容進行簡單總結分享。
多肽藥物從20世紀初就開始用于臨床，早期主要是從天然產物中提取，包括激素替代物胰島素、促腎上腺皮質激素、抗菌藥桿菌肽、多粘菌素B等。20世紀70年代開始，合成的激素類藥物開始出現，包括去氨加壓素、性腺激素等。隨著技術的發展，目前重組表達技術逐漸成為主流，包括甲狀旁腺激素和胰高血糖素、杜拉魯肽、胰島素類似物等。已經有超過100種肽類藥物上市。
多肽類藥物是如何定義的呢？關于這點，其實是有一定爭議的。通常，多肽藥物氨基酸數量在3-100之間。一些非核糖體肽來源的分子，比如棘白菌素抗真菌藥卡泊芬凈、米卡芬凈，脂糖肽類抗菌藥萬古霉素、達巴萬星、特拉萬星，以及其它天然產物衍生的非核糖體肽藥物環保菌素、博來霉素等，FDA認為屬于小分子類別。而用重組DNA技術表達的分子量更大的線性肽，如胰島素類似物、甲狀旁腺激素、人胰島素生長因子、重組水蛭素等，雖然很多情況是由FDA CDER部門審評（生物藥通常由CBER審評），但通常被視為生物藥。2020年3月，FDA對肽類藥物進行了分類，對于重組表達的超過40個氨基酸的分子被視為生物藥物，按照BLA管理。對于小于40個氨基酸的分子（無論通過何種途徑制備），或者通過化學合成制備的小于100個氨基酸多肽，被視為新分子實體，按照NDA途徑申請。比如已經上市的GLP-1受體激動劑， Fc融合的度拉糖肽和白蛋白融合的阿必魯肽氨基酸數量遠超40個，按照BLA路徑申報。艾塞那肽39個氨基酸組成，化合學成所得，按照NDA路徑申報。
多肽藥物在小分子和大分子之間的游走、不確定性，為這類藥物的非臨床評價帶來很多挑戰，是遵循化藥的指南還是生物藥的法規呢？所屬類別不同，種屬選擇邏輯、免疫原性評估等方面均會有區別。
一般毒理
雖然ICH M3（R2）提及多肽藥物不在該指南范圍內，ICH S6（R1）則將化學合成或重組表達的多肽納入指導范圍，但實際情況是，幾乎所有多肽類藥物均參照了ICH M3（R2）開展嚙齒類和非嚙齒類毒理研究。不過，FDA綜述資料里面并未提及如何選擇的種屬，從結果看，89%（41/46）嚙齒類種屬選擇的大鼠，非嚙齒類則比較均衡，46%（21/46）采用的犬，54%（25/46）選擇的食蟹猴。多肽類藥物的種屬選擇應該參照生物藥思路更多一些。
74%嚙齒類研究最長給藥周期持續超過6個月（C圖），74%非嚙齒類研究最長給藥周期持續超過9個月（D圖）。當然，這是最長給藥周期，通常用于支持產品NDA/BLA，支持IND一般不需要開展如此長周期的研究，可根據臨床試驗方案和推進進度，分階段開展。另外，大部分肽類藥物適用于慢性病如糖尿病等治療，用藥周期長，超過3個月，所以最長給藥周期基本是指導原則要求的上限。
生殖和發育毒性
幾乎所有多肽藥物均開展了Ⅰ段嚙齒類生育力研究、Ⅱ段嚙齒類或家兔胚胎-胎仔發育毒性研究和Ⅲ段嚙齒類出生前、出生后發育毒性研究。具體比例參見下圖。
含非蛋白質氨基酸的多肽
非蛋白質氨基酸（Non-Proteogenic Amino Acids, NPAA）是相對于組成蛋白質的20種常見氨基酸而言，指除組成蛋白質的20種常見氨基酸以外的含有氨基和羧基的化合物。有時為改善靶點親和力或穩定性，會考慮引入非蛋白質氨基酸。NPAA既可以是天然氨基酸也可以是非天然氨基酸。21/47（45%）多肽類藥物含有至少1個NPAAs，平均3.5個NPAAs。那么含有NPAAs的肽類藥物需要額外開展毒理研究嗎？大多數藥物未被要求開展額外研究，哪怕使用的NPAA非常新，從未在多肽類藥物中使用過。40多個多肽藥物中，只有2例藥物被FDA要求開展額外毒理研究，bivaluridine和icatibant。原因是這兩個藥物原液的雜質中均含有2個NPAAs，額外開展了重復給藥毒性或細菌回復突變試驗。
免疫原性測定
67%（21/46）的肽類藥物進行了ADA檢測，其中19/21開展了臨床前和臨床的ADA檢測。比較有意思的是凡是臨床前ADA陽性的藥物，臨床的ADA檢測結果也是陽性的。反之則不成立，臨床前陰性的，臨床既有陽性也有陰性。ADA的產生與分子大小相關，產生ADA的肽類藥物氨基酸數量為8-84個。不過，90%的肽類藥物產生的ADA對藥物的PK和藥效沒有影響。還有一個現象，76% ADA陽性的藥物并未進行中和抗體檢測。以上描述性統計結果可以看出，通常小分子不做ADA檢測，生物藥基本都會做，肽類藥物介于二者之間，三分之二的藥物開展了ADA檢測。其實很多小肽免疫原性很低，即使添加佐劑，想獲得抗藥抗體都不太容易，所以肽類藥物因免疫原性影響成藥的風險較傳統生物藥低很多。但如果多肽分子量比較大，比如有幾十個氨基酸，或者很多多肽藥物做了長效化修飾，比如融合了人Fc、PEG等，或者不同靶點的多肽進行了融合，ADA的風險提高，評估起來就需要更加謹慎。
雜質研究
關于雜質問題，更多還是來自化藥評價的思路。57%（16/28）的經化學合成、半合成的多肽藥物被FDA要求開展單獨的雜質毒理研究，包括體外遺傳毒性或一般毒理研究。但關于多肽藥物雜質問題，其實沒有很明確的說法，能參考的指南還是ICH Q3A和ICH Q3B。
生物轉化和PK研究
對于合成、半合成多肽，基本都開展了詳細的生物轉化研究，包括體外代謝、代謝物結構表征、代謝物體內表征等，類似化藥的思路。
遺傳毒性研究
通常生物藥是不需要開展遺傳毒性研究的。對于化藥，細菌回復突變、染色體畸變及體內微核的遺傳毒性組合試驗是需要開展的。肽類藥物雖然介于二者之間，但85%（39/46）的藥物開展了遺傳毒性相關試驗。39個肽類藥物的組成是：100%化學合成多肽（21/21）、61%（11/18）重組肽、100%（6/6）半合成肽、1個天然肽。不難看出，對于全合成、半合成肽、天然肽，通常需要開展遺傳毒性研究，重組表達肽則要視情況而定，不是必須的。而且，全合成、半合成肽、天然肽開展的是完整的遺傳毒性標準組合試驗，11個開展遺傳毒研究的重組肽中，僅7個開展了完整標準組合試驗，剩余4個僅選擇性開展了其中部分試驗。39個多肽中僅2個出現陽性，而且是細菌回復突變陽性，染色體畸變陰性。這2個細菌回復突變陽性的多肽，glucagon和etelcalcetide，前者之后被證明是假陽性，后者經進一步體內外遺傳學研究后，也判定為遺傳毒性陰性。所以，39個開展遺傳毒性研究的多肽，結果都是陰性的。
安全藥理學
按照ICH S7B，49%（20/41）多肽藥物開展了體外鉀離子通道安全藥理研究—hERG試驗。大多數多肽藥物開展了單獨的大鼠和/或犬的心血管和呼吸系統安全藥理學研究，個別采用非人靈長類進行的研究。
致癌試驗
50%（23/46）的多肽藥物開展了致癌性研究。其中，16/23開展了兩個嚙齒類種屬的致癌試驗，7/23僅開展了1個嚙齒類種屬的研究。不開展致癌試驗的原因包括：1）臨床給藥周期短；2）腫瘤適應癥；3）ADA的影響；4）有些作用機制產品已明確致癌風險，企業在說明書中直接注明致癌陽性，如GLP-1激動劑引發的甲狀腺C細胞腫瘤。
13/23個開展致癌試驗的肽類藥物的結果是陽性的，其中7個作用于GLP-1靶點。前文已經提及，所有多肽藥物的遺傳毒性結果都是陰性的，故致癌陽性基本都是藥物藥理作用引起的。比如胰島素具有促有絲分裂的作用，賴谷胰島素和甘精胰島素對嚙齒類動物具有致癌作用。
總結
對于化藥、生物藥沒有太大區別的試驗，比如生殖毒性、安全藥理、致癌，無論大分子還是小分子，需不需要開展，考量的因素是類似的。但對于ADA評價、遺傳毒性、體外代謝、雜質研究、相關動物種屬選擇，就需要明確多肽藥物的歸屬，到底是按照M3還是S6。由于缺少特定的針對多肽藥物的指南，多數多肽類藥物還是按照化藥的思路開展非臨床安評。沒有統一的指南，就很難有統一的行業操作標準，大家也是根據自己的理解、過往產品的研究經驗，化藥和生物藥交叉結合的思路設計非臨床試驗。已經上市的多肽類藥物很多，可以根據自己產品的特點比如靶點、作用機制、適應癥等，結合已上市藥物的經驗，必要時跟監管機構溝通，合理設計非臨床研究策略。
