利用芽孢桿菌殼聚糖酶BsCsn46A將殼聚糖生物轉(zhuǎn)化為可溶性抗炎殼聚糖低聚糖（CHOS）。酶促反應(yīng)48 h后，大部分最終產(chǎn)物為二聚體和三聚體。所有CHOS產(chǎn)物對人成纖維細(xì)胞都沒有毒性。CHOS對LPS誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞炎癥生物活性分析表明，不同生物轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)生的CHOS具有抗炎活性，其大小取決于底物的類型和生產(chǎn)過程。乳酸和鹽酸均可用于溶解殼聚糖；但乳酸溶液生成的產(chǎn)物經(jīng)凍干后吸濕性較高，不適合長期儲存。離心和過濾都會影響其抗炎活性。對已知結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)CHOS分析表明，還原性乙酰基和聚合度（DP）對CHOS的生物活性至關(guān)重要。重要的是，當(dāng)應(yīng)用水平高于最佳濃度時，某些標(biāo)準(zhǔn)的CHOS和CHOS混合物可能誘發(fā)炎癥。這些結(jié)果支持CHOS作為抗炎藥物的潛力，揭示批次間的變化和可能的副作用，表明CHOS制劑的質(zhì)量保證是必要的。
相關(guān)研究內(nèi)容以“Valorization of shrimp processing waste-derived chitosan into anti-inflammatory chitosan-oligosaccharides (CHOS)”為題于2023年11月2日發(fā)表在《Carbohydrate Polymers》。泰國素羅娜麗科技大學(xué)的Montarop Yamabhai作為文章一作兼通訊。
圖1 小型、大規(guī)模CHOS生產(chǎn)過程示意圖
由于CHOS相對于化學(xué)和物理方法的優(yōu)勢，以及控制降解反應(yīng)的能力，因此采用酶水解法生產(chǎn)CHOS。本研究中小規(guī)模和大規(guī)模的CHOS生產(chǎn)示意圖如圖1所示。該過程可分為3個主要部分。首先利用大腸桿菌或食品級植物乳桿菌的表達(dá)來生產(chǎn)重組BsCsnA，然后將殼聚糖粉末溶于溫和酸中的CHOS生產(chǎn)的上游進行加工，最后是CHOS溶解的下游加工過程。
圖2 不同生物轉(zhuǎn)化條件（CD1-5）產(chǎn)生的CHOS抗炎活性
在48 h時收集最終的水解產(chǎn)物。對使用鹽酸或乳酸的反應(yīng)實現(xiàn)100%的生物轉(zhuǎn)化，即殼聚糖解聚。接下來使用五種不同的處理條件（CD1-5）產(chǎn)生不同CHOS產(chǎn)物的抗炎特性，使用先前建立的基于測量LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中分泌的IL-1β（圖2）。雖然效果大小存在差異，但所有CHOS制劑都顯示出抗炎活性。一般來說，液體材料比粉末狀（凍干）材料效果更好。乳酸中產(chǎn)生的液體和粉末狀CHOS（圖2a）的抗炎活性均優(yōu)于鹽酸中產(chǎn)生的CHOS（圖2e）。通過質(zhì)譜檢測CD1 - CD5反應(yīng)的最終產(chǎn)物混合物中的CHOS（圖2f）。
圖3 不同殼聚糖來源產(chǎn)生的CHOS生物活性比較
本研究中使用的殼聚糖由泰國兩家成熟的殼聚糖供應(yīng)商提供，分別指定為A公司（Co. A）和B公司（Co.B）。Co. A的殼聚糖是食品級的，呈灰白色外觀，由熱帶海洋干蝦殼產(chǎn)生。Co.B的殼聚糖為飼料級，灰白色薄片。圖3顯示所得液體和粉末狀CHOS制劑的薄層色譜分析和抗炎活性。總的來說，Co. A和Co.B的CHOS產(chǎn)物模式相同，二聚體和三聚體占主導(dǎo)地位。兩種CHOS制劑均顯示出抗炎作用。這些觀察表明，CHOS的生物活性和可能的副作用取決于部分殼聚糖來源，從不同生產(chǎn)過程中獲得的CHOS產(chǎn)品的整體結(jié)構(gòu)微小差異可能導(dǎo)致對人類細(xì)胞的生物效應(yīng)的重大差異。
圖4 用食品級植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)分泌產(chǎn)生BsCsnA
在5-L生物反應(yīng)器中分泌產(chǎn)生重組BsCsnA的結(jié)果如圖4所示。在OD值為600nm時，細(xì)胞密度增加（紅線）與培養(yǎng)基中BsCsnA活性增加相一致（藍(lán)線）。孵育15 h時，酶活性達(dá)到74000 U/L。植物乳桿菌的生長與培養(yǎng)基中葡萄糖的減少（綠線）相對應(yīng)。該酶可以從培養(yǎng)上清液中純化。
圖5 殼聚糖大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化為CHOS的時間過程
通過薄層色譜法和測量反應(yīng)混合物的粘度來監(jiān)測產(chǎn)物的形成（圖5）。TLC結(jié)果顯示，6h后可檢測到CHOS，主要是DP3、DP4和DP5。水解48 h后，CHOS主要由二聚體和三聚體組成。
圖6 CHOS的生物活性來源于更大規(guī)模的生物生產(chǎn)
使用MTT試驗評估了潛在的細(xì)胞毒性。圖6a顯示，對任何一種測試的CHOS濃度均未觀察到細(xì)胞毒性效應(yīng)。為了確定不同下游過程如何影響CHOS的抗炎活性，將大規(guī)模生產(chǎn)的水解反應(yīng)混合物分為三部分：1）不需要離心直接凍干；2）凍干前離心；3）凍干前通過0.2um尼龍膜過濾器進行過濾。圖6b顯示了不同的CHOS制劑在不同濃度（0.1~100 ug/mL）下的抗炎活性，用于預(yù)處理人THP-1巨噬細(xì)胞24小時，然后用LPS刺激巨噬細(xì)胞。
圖7 商業(yè)化CHOS標(biāo)準(zhǔn)品的抗炎特性比較
用濃度為1~500ug/mL各種標(biāo)準(zhǔn)低聚糖，即D2、D3、D4、D5、D6、DA、AD、AA和AAA檢測其抗炎活性。結(jié)果證實CHOS的生物活性受到乙酰化模式的影響（圖7）。去乙酰化的低聚物（D2-D6）除高劑量的六聚體外，只有輕微的抑制作用（圖7a）。相反，非乙酰氨基葡萄糖的二聚體（AA）和三聚體（AAA）均表現(xiàn)出較強的抗炎活性（圖7b）。比較四種二聚體（DD、DA、AD、AA）的活性，結(jié)果表明還原端A（N-乙酰氨基葡萄糖）是CHOS生物活性的關(guān)鍵。DA輕微誘導(dǎo)炎癥，AA誘導(dǎo)IL-1b分泌明顯強于AAA（圖7c）。以上結(jié)果證實乙酰化程度（DA）可以極大地影響CHOS的抗炎活性。
綜上所述，本研究建立了利用食品級植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的酶將殼聚糖轉(zhuǎn)化為可溶性殼聚糖（CHOS）的過程。從食品或飼料級殼聚糖中產(chǎn)生的CHOS產(chǎn)物沒有顯示出對人類細(xì)胞的毒性。雖然大多數(shù)CHOS制劑對LPS誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞炎癥提供保護，但數(shù)據(jù)顯示，生物轉(zhuǎn)化條件的變化可能會影響其抗炎活性，如殼聚糖的來源、實際的水解反應(yīng)和下游加工。對于某些制劑，當(dāng)高劑量應(yīng)用時可以觀察到炎癥的刺激。標(biāo)準(zhǔn)CHOS的抗炎活性分析表明，非乙酰氨基葡萄糖(A)在還原端和聚合度（DP）的乙酰基對CHOS的生物活性至關(guān)重要。為了克服這些挑戰(zhàn)，必須進行可靠的殼聚糖原料的質(zhì)量保證和精確的上游、下游生物工藝標(biāo)準(zhǔn)操作實踐（SOP），然后進行體外抗炎活性測試。此外，在申請不同生物工藝生產(chǎn)的CHOS之前，應(yīng)進行適當(dāng)?shù)呐R床前試驗和人體研究，以確保CHOS的有效和安全使用。未來的工作應(yīng)集中于優(yōu)化上游、下游的生物轉(zhuǎn)化過程，以獲得CHOS制劑中最有效的生物活性低聚物。
文章來源：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121546
