本文以研究油浴儀法測定 D 值的影響因素為目的，采用殘存曲線法多次測定同一批嗜熱脂肪芽孢桿菌在氯化鈉注射液中的 D 值，根據(jù)不同條件下 D 值測定結(jié)果的比較，確定 D 值測定的影響因素。通 過比較 0.05 mL、0.5 mL、1.0 mL 三種菌液量，以及毛細(xì)管、安瓿瓶兩種分裝方式的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，安瓿瓶分裝 0.5 mL 菌液 6 次測定 D 值均在標(biāo)示 D 值的 80％～ 120％之間，測定結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定。因此，本文建議油浴儀測定 D 值時(shí)將菌液分裝在安瓿瓶中，每瓶分裝 0.5 mL，并關(guān)注油浴儀溫度的均勻性和穩(wěn)定性。

在濕熱滅菌工藝中，可以通過檢驗(yàn)生物指示劑滅菌后的存活情況來驗(yàn)證滅菌效果 [1-5]。生物指示劑是指將特殊活微生物采用特定方法制備成對特定滅菌工藝有耐受性的一種生物制品，一般選用比普通微生物有更強(qiáng)耐受性的微生物[4]。生物指示劑目前主要有三種類型：芽孢懸液型、自含式、載體型生物指示劑 [6-10]。

評(píng)估生物指示劑的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)主要有總芽孢數(shù)、D 值。總芽孢數(shù)即產(chǎn)品存活孢子數(shù)。D 值指在一定暴露條件下，將試驗(yàn)微生物殺滅 90% 所需的滅菌時(shí)間 / 劑量 [11-13]。D 值越大說明微生物死亡速率越慢，耐熱性也越強(qiáng)。D 值會(huì)受到菌種、細(xì)菌或芽孢菌懸液的性質(zhì)、 滅菌溫度 / 劑量影響，不受初始細(xì)菌數(shù)量的影響。

D 值在滅菌設(shè)備的性能確認(rèn)、特定滅菌工藝的開發(fā)、生產(chǎn)過程滅菌效果的檢測及評(píng)估方面具有重要作用。檢測 D 值的方法主要有陰性分?jǐn)?shù)法和殘存曲線法 [14]，測定的 D 值應(yīng)在標(biāo)示 D 值的 80％～120％之內(nèi)。

為驗(yàn)證擬定的滅菌工藝是否能讓產(chǎn)品達(dá)到要求的無菌保證水平，本研究以油浴儀測定嗜熱脂肪芽孢桿菌在氯化鈉注射液中的 D 值為例，分析油浴過程并確定關(guān)鍵點(diǎn)，建立油浴儀殘存曲線法測定 D 值方法，測定嗜熱脂肪芽孢桿菌在氯化鈉注射液中的 D 值，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)產(chǎn)品滅菌工藝生物學(xué)挑戰(zhàn)驗(yàn)證。

1、材料

本實(shí)驗(yàn)主要使用以下試劑、培養(yǎng)基和儀器（見表 1、表 2、表 3、表 4）。

表 1 嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子懸液產(chǎn)品信息

表 2 試驗(yàn)樣品

表 3 培養(yǎng)基

表 4 儀器

2、方法與結(jié)果

采用油浴儀測定嗜熱脂肪芽孢桿菌在氯化鈉注射液中的 D 值，分析油浴過程并確定關(guān)鍵點(diǎn)，建立油浴儀殘存曲線法測定 D 值方法。

2.1 油浴儀結(jié)構(gòu)

油浴儀是一種可以設(shè)定 100℃以上的恒溫設(shè)備，由機(jī)箱、恒溫油槽、控溫系統(tǒng)等 3 部分組成。油浴儀以硅油為介質(zhì)，控溫系統(tǒng)控制油浴儀的各個(gè)位置溫度的均一性。結(jié)構(gòu)見圖 1。

圖 1 油浴儀結(jié)構(gòu)圖

2.2 供試品 D 值測定試驗(yàn)方法

菌液體積選擇 0.05 mL、0.5 mL、1 mL 三種，其中 0.05 mL 菌液每組共 6 支毛細(xì)管；0.5 mL 和 1 mL 菌液每組共 4 支。

2.2.1 孢子懸液的供試品溶液制備

取合格的孢子懸液，加入到氯化鈉注射液中，將孢子懸液制備成孢子數(shù) 為 5×105 ～ 5×106 cfu/mL 的供試品溶液。其中，0.05 mL/ 支毛細(xì)管的 D 值測定孢子懸液取樣體積為 0.05 mL ；安瓿瓶測定需要菌液體積孢子懸液體積分別為 0.5 mL 或 1 mL。

2.2.2 分裝和密封

采用注射器將 0.05 mL 菌液注射至毛細(xì)管中，采用移液器將 0.5 mL、1 mL 菌液轉(zhuǎn)移至安瓿瓶中。采用酒精噴燈對上述樣品進(jìn)行封口，封口時(shí)避免酒精噴燈火焰對孢子造成損傷。封口后，進(jìn)行封口效果檢測，排除漏液的樣品。

2.2.3 滅菌處理

將制備好的含孢子懸液的供試品分為 7 組，于 121℃恒溫油浴鍋中進(jìn)行滅菌處理，每組滅菌時(shí)間分別為 0 min、 2.5 min、5 min、7.5 min、10 min、 12.5 min、19 min。滅菌后，樣品放入冰水中冷卻，并冷藏，在 2 h 內(nèi)進(jìn)行殘余孢子計(jì)數(shù)。

2.2.4 殘余孢子計(jì)數(shù)

將各試驗(yàn)組樣品，置于超聲波儀上充分混勻，表面消毒后，取出供試品液 （盡可能全部取出，無明顯殘留）。未經(jīng)滅菌處理的樣品在 95℃～ 100℃水浴熱 激 15 min（以供試品達(dá)到設(shè)定溫度開始 計(jì)時(shí)），熱激完成后取出樣品，迅速放入冰水中冷卻。采用 10 倍遞增稀釋法，逐級(jí)稀釋至適宜梯度進(jìn)行計(jì)數(shù)，其余組混勻后直接稀釋計(jì)數(shù)。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果，取滅菌時(shí)間為橫坐標(biāo)，存活孢子數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖，D 值為該直線斜率的負(fù)倒數(shù)，計(jì)算嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子在溶液中的D 值。

計(jì)算公式：y= kx+b D121℃ = -1/k （式中：k 為直線方程式的斜率）。 

結(jié)果判斷：計(jì)算出孢子懸液在產(chǎn)品介質(zhì)溶液中的 D 值與孢子懸液標(biāo)示 D 值比較，判斷所測 D 值是否在標(biāo)示 D 值的 80% ～ 120% 范圍內(nèi)，線性回歸 R2 需大于 0.80。 

2.3 試驗(yàn)結(jié)果 

采用油浴儀對孢子懸液 D 值測定共 10 次：其中分裝 0.05 mL 菌液（采 用毛細(xì)管分裝）試驗(yàn) 2 次；1 mL 菌液（采 用安瓿瓶分裝）試驗(yàn) 2 次；0.5 mL 菌液 （采用安瓿瓶分裝）試驗(yàn) 6 次。 

2.3.1 0.05 mL 菌液 D 值測定結(jié)果 

采用毛細(xì)管分裝 0.05 mL 菌液，樣品分為 7 組，每組 6 支，油浴后，進(jìn)行殘余孢子數(shù)計(jì)數(shù)。共試驗(yàn) 2 次，結(jié)果見表 5。

表 5 0.05 mL 菌液 D 值測定

2.3.2 1 mL 菌液 D 值測定結(jié)果

采用安瓿瓶分裝 1 mL 菌液，樣品分為 7 組，每組 4 支，滅菌時(shí)間間隔為 2.5 min，油浴后，進(jìn)行殘余孢子數(shù)計(jì)數(shù)。共試驗(yàn) 2 次，計(jì)數(shù)結(jié)果見表 6。

表 6 1 mL 菌液 D 值測定

2.3.3 0.5 mL 菌液 D 值測定結(jié)果

采用安瓿瓶分裝 0.5 mL 菌液，樣品分為 7 組，每組 4 支，滅菌時(shí)間間隔為 2.5 min，油浴后，進(jìn)行殘余孢子數(shù)計(jì)數(shù)。共試驗(yàn) 6 次，計(jì)數(shù)結(jié)果見表 7。

表 7 0.5 mL 菌液 D 值測定

2.3.4 D 值計(jì)算

取滅菌時(shí)間為橫坐標(biāo)，存活孢子數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，D 值為該直線斜率的負(fù)倒數(shù)，計(jì)算公式：y=kx+b，D121℃ = -1/k （式中：k 為直線方程式的斜率）。D 值計(jì)算結(jié)果見表 8。

表 8 D 值計(jì)算結(jié)果

3、討論

3.1 D 值測定結(jié)果分析

根據(jù)油浴儀殘存曲線法 D 值測定結(jié)果分析，由表 8 可知：采用 0.5 mL 菌液體積的試驗(yàn)，測定 D 值為標(biāo)示 D 值的 91%、119%、110%、 111%、115%、113%，均在標(biāo)示值的 80% ～ 120% 之間，而采用 0.05 mL 菌液體積測定 D 值為標(biāo)示 D 值的 124%、148%，采用 1 mL 菌液體積測定 D 值為標(biāo)示 D 值的 145%、156%， 均未在標(biāo)示 D 值的 80% ～ 120% 之間。因此采用 0.5 mL 菌液體積進(jìn)行 D 值測定較好，測定 D 值更準(zhǔn)確。 

3.2 不同菌液量之間的比較 

不同的菌液體積影響了菌液的分裝載體，0.05 mL 菌液體積采用毛細(xì)管分裝，0.5 mL 和 1 mL 菌液采用安瓿瓶進(jìn)行分裝。①樣本用量比較：采用毛細(xì)管進(jìn)行 D 值測 定，每組樣品≥ 6 支，安瓿瓶每組樣品≥ 4 支，在分裝次數(shù)上安瓿瓶分裝次數(shù)少于毛細(xì)管，但總體積為毛細(xì)管最少。②分裝方法比較：毛細(xì)管采用注射分裝體積，分裝時(shí)針頭需伸入毛細(xì)管中，而安瓿瓶采用移液器進(jìn)行分裝，因此采用安瓿瓶分裝比毛細(xì)管分裝更簡便。③載體比較：載體不同也會(huì)對樣品孢子回收率產(chǎn)生影響，毛細(xì)管體積少，回收困難，回收率低。④油浴溫度的影響：菌液體積越大吸收的熱量越多，對油浴溫度的影響也越大，對樣品的滅菌效果出現(xiàn)較大的影響。 

3.3 儀器性能對于 D 值測定的影響 

影響測定嗜熱脂肪芽孢桿菌在氯化鈉注射液中 D 值的主要因素為溫度、時(shí)間，而其中溫度對于滅菌效果的影響非常顯著。采用油浴儀進(jìn)行 D 值測定，油浴儀對溫度穩(wěn)定控制較弱，采用循環(huán)管道平衡各位置的溫度，受循環(huán)泵和硅油流動(dòng)速度的影響，油浴儀各位置溫度均一性較差。由于油浴儀內(nèi)的樣品放置的位置不同，因此每個(gè)樣本所處位置的溫度不完全一致，放入樣品后，吸收熱量導(dǎo)致局部溫度出現(xiàn)下降， 滅菌效果下降，可能會(huì)對測試結(jié)果有一定影響。這也可能是上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中測定的 D 值均比標(biāo)示 D 值大的原因之一，真實(shí)值比測定值小，出現(xiàn)誤差。因此，測定 D 值所需的硬件設(shè)備對于 D 值測定準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

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本文作者申景豐，蔣芙蓉， 湯平， 余衛(wèi)國，夏博， 陳超，僅供交流學(xué)習(xí)。