編者按
有效性評價是發現中藥藥效物質基礎、先導化合物和質量標志物的重要前提，因此亟需建立一種生物學語言，將中藥有效性科學地表達出來，進一步凸顯中醫藥的實用價值。
中國工程院院刊《Engineering》2019年第1期刊發黑龍江中醫藥大學王喜軍教授研究團隊的《中醫方證代謝組學——中藥效應評價的有效途徑》一文。文章概述中醫方證代謝組學的研究策略，揭示臨床常見中醫證候生物標記物及開展相關方劑的有效性評價研究，著重闡述中藥藥效物質基礎及質量標記物的發現。
一、引言
由于人類疾病譜的變化，單靶點、單一藥物的簡單治療模式難以解決多靶點復雜性疾病的治療問題，個體化的精準治療又對現代醫學提出了新的挑戰。多靶點作用的中藥在復雜疾病的治療中較單靶點藥物具有獨特優勢，中藥的多靶點治療及中醫學辨證論治個體化治療的精準潛力等在解決多靶點復雜性疾病治療方面積累了大量有價值的臨床經驗。然而，中藥有效性是中醫治療優勢的根本體現，也是橫在中醫學與現代醫學科學家之間難以逾越的鴻溝，致使中醫學的優勢及其臨床經驗的價值難以被充分接受。
中藥有效性應該包括3個方面的內容，即臨床效應、效應機制及效應成分。首先，中藥有效性在臨床上是以方劑為用藥形式針對證候表達的，只有在精準辨證的基礎上實現方證對應才能充分表達中藥的臨床療效。任何超越了證候與方劑而研究有效性的方法都將與中醫臨床實踐脫節。從單味中藥研究獲得的結論必將由于配伍其他藥物而改變，同一中藥在不同方劑配伍環境下，在體內將表達（吸收）不同的成分，從而實現配伍的藥效取向。因此，研究中藥有效性必須從證候和方劑入手，在方證對應狀態下闡釋效應、效應機制及效應成分。
由此，通過整合代謝組學與中藥血清藥物化學技術，以證候生物標記物發現為切入點，以方劑為研究對象，建立了集闡明效應、揭示效應機制及鑒定效應成分于一體的中藥有效性研究的新策略——中醫方證代謝組學，即利用代謝組學技術發現并鑒定中醫證候（病）的生物標記物，以生物標記物為參數評價方劑的臨床療效；在有效狀態下，以中藥血清藥物化學技術分析鑒定方劑進入體內的顯效成分，將其與證候生物標記物軌跡回調相關聯，挖掘與生物標記物軌跡變化高度關聯的進入體內的方劑成分，從而鑒定表達方劑臨床療效的藥效物質基礎并闡明其效應機制，解決創新藥物設計、質量標記物發現、方劑配伍規律等與有效性相關的科學問題（圖1）。該理論及方法充分體現了中醫辨證論治、方證對應的理論特點及臨床實踐的要求，為深度理解并挖掘中醫理論的科學價值及中醫臨床經驗的實用價值提供了新策略。
圖1 中醫方證代謝組學：整合代謝組學與血清藥物化學來評價中醫藥有效性的策略
二、中藥有效性評價面臨挑戰
中醫藥的發展深受中國古代哲學思想的影響，包括在中醫診療中有充分體現的陰陽學說、整體觀、辨證論治等思想。整體觀與辨證論治是中醫診斷及治療疾病、提高臨床療效優勢的基本特點。中醫治病用的是方劑，而方劑對應的是證，證是中醫對病的描述，基于眾多的癥狀綜合描述分析獲得，涉及思維層面，缺少客觀的標準，具有模糊性，且難以重現。由天然草藥、動物、礦物質等按君臣佐使配伍原則組成的方劑，是中醫藥治療疾病的基本形式。單味中藥所含化學成分數以百計，由多種中藥組成的方劑已成為高度復雜的化學巨系統，導致藥效物質基礎的確認困難重重。
眾多中醫學專家目前致力于中醫藥治療優勢的全球化發展。然而，由于中醫理論的復雜性，其功效不能用現有的有限藥理學指標來表達。現代醫學家甚至是生命科學領域的科學家都難以認識并接受中醫臨床經驗的實用價值。因此，對中醫藥療效的科學解釋已成為國內外醫學科學家不可逾越的障礙，限制了中醫藥治療優勢和臨床經驗的充分利用。
在國際醫學領域，中醫的整體觀及個體化治療理念逐漸被認可。然而中醫證候的診斷和評價標準依賴個人總結經驗和經典古籍描述，導致中醫證候缺乏標準化、系統化和現代化，以及臨床使用的客觀性和標準化。因此，中醫藥最新進展聚焦于如何表達方劑的物質基礎和證候的科學內涵。諸如此類問題使中醫藥學的現代化發展停滯不前。
三、中醫方證代謝組學——研究策略和技術
證候模糊性和方劑復雜性導致疾病診斷和有效性評價困難重重，并且極大地限制了中藥有效成分的發現。方劑有效性和證候生物學本質研究是中醫藥的重要科學問題。中藥血清藥物化學理論建立于20世紀90年代初，提供了發現中藥在人體內的活性成分的方法，解決其相關療效和安全性問題。21世紀初，中藥血清藥物化學理論整合代謝組學方法構建了中醫方證代謝組學創新策略，用于闡明證候本質和中藥功效并發現其有效成分。如前所述，中醫方證代謝組學方法可揭示證候的候選生物標志物、相應方劑功效及藥理機制，同時促進證候的精準診斷，挖掘臨床治療經驗，為提高中醫科學價值提供了有效策略。
（一）代謝組學技術
盡管中藥血清藥物化學已成為探索中藥效應成分的有效方法，然而由于當時分析技術的局限，檢測及表征體內成分的能力不足，它只考慮定性或定量的化學成分，并沒有考慮到效應評價。只有在治療有效性的前提下，將體內化學成分與中藥療效相關聯，才能揭示中藥的有效成分。因此，我們引入代謝組學建立新的研究方法來彌補中藥血清藥物化學在解決效應評價方面的不足。
代謝組學是系統生物學的重要組成部分，研究思路與中醫藥整體觀不謀而合，針對中藥復雜性和效應整體性，綜合考慮中藥方劑體內化學成分的變化，其特征與中醫藥的整體觀念一致，表明代謝組學可促進證候本質和方劑復雜作用機制解析。
“辨證論治，方證相應”是中醫藥治病基本原則。方劑療效評價必須基于對證候的科學闡釋。中醫證候是一種功能狀態，是機體對體內外各種環境變化和致病因素做出的反應，它的本質是由機體不平衡而引起的代謝網絡變化，這些內源性代謝成分變化反映證候生物學表型。
代謝組學技術通過對內源性小分子代謝物的非歧視性分析，獲得反映機體功能狀態的代謝指紋特征和代謝網絡。利用代謝組學技術可表征證候生物標志物，闡明證候生物學本質，為證候診斷和相關動物模型的建立提供科學依據。利用代謝輪廓、代謝指紋、生物標記物可建立既符合中醫特征又適合中醫藥研究的藥效生物評價系統。
（二）中藥血清藥物化學理論
中藥血清藥物化學主要用于中藥物質基礎分析。雖然中藥成分復雜，但只有被血液吸收的成分才可能發揮治療作用。這些成分包括原型成分和代謝產物。該方法已經用于篩選口服給藥后體內有效物質的研究。方劑在配伍環境下藥物在體內表達相關活性及相互作用。當在不同方劑和病理條件下，相同的中藥可以表達不同的藥效物質。因此，利用中藥血清藥物化學方法研究中藥物質基礎應從臨床配伍的有效方劑入手。檢測血液中的化學成分是中藥血清藥物化學理論的關鍵研究部分。隨著液相色譜/質譜（LC/MS）技術，特別是具有高分辨率質譜串聯超高效液相色譜的快速發展，快速檢測和鑒定體內成分的能力已大大提高。這促進了中藥血清藥物化學方法的進一步普及。液相色譜和質譜的串聯使用提供了用于鑒定血液中代謝組分的有效檢測方法，可全面獲得直接作用物質信息。然而該技術也可檢測體內內源性物質成分，嚴重影響中藥外源性成分鑒定。因此，應在LC/MS數據處理過程中引入新方法解決該問題。
目前質量缺陷過濾（MDF）技術用于提取同源組分。它通過設置適當的質量范圍和多個過濾參數來分析質譜數據，從而濾除大量內源性干擾。背景扣除是一種以空白樣品作為參照過濾掉含藥生物樣品中相同離子的分析技術。其他用于藥物代謝的分析軟件，如MetaboLynx和UNIFI，與預測代謝途徑分析相結合可實現數據自動提取和代謝物輔助鑒定。
（三）整合中藥血清藥物化學與代謝組學
在20世紀90年代早期，提出并建立了從含有血清的口服制劑中發現體內直接作用物質的研究設計。然而，由于當時沒能有效地解釋中醫證候生物標志物，因此尚未建立用于方劑功效的精準評價系統，還不能將體內成分與中藥功效有效聯系起來。21世紀初，證候生物標志物發現和體內成分分析同步完成，在方劑有效狀態下，將方劑體內成分與證候生物標志物相關聯確定潛在有效物質。以方劑為研究對象，利用代謝組學發現和鑒定證候/疾病生物標志物，建立方劑療效評價體系，闡明方劑功效，分析治療有效狀態下體內直接作用物質，進而將其與證候生物標志物相關聯，鑒定與生物標志物軌跡變化高度相關的組分，確定有效物質并解析作用機制，解決了一系列與中藥有效性相關的科學問題。總之，利用代謝組學技術揭示證候生物學機制，采用中藥血清藥物化學發現體內活性物質，在有效性評價前提下對體內成分和生物標志物進行相關分析，揭示與方劑功效有關的效應成分。
整合中藥血清藥物化學與代謝組學構建中醫方證代謝組學研究策略，揭示中醫藥的科學價值。2015年，愛思唯爾出版了Chinmedomics 。中醫方證代謝組學受到廣泛關注，成為評價中藥療效以確定其效應物質的有效策略。為了確定方劑功效相關成分，采用皮爾遜相關法建立PCMS方法模型，利用r系數顯示化學成分與體內生物標志物之間的關聯程度。該模型用于分析證候生物標志物的動態變化，辨識體內直接作用物質，發現與臨床療效高度相關的關鍵成分。由于中藥多組分作用于生物標志物，應進一步建立關鍵組分的動態優化模型，篩選最優的多組分候選化合物。
（四）關鍵技術和注意事項
該研究成果突破了以往的活性導向分離等天然藥物研究活性成分方法的局限，使藥效物質基礎的研究緊密結合證候及方劑，使發現的藥效物質基礎與臨床療效相關聯，打破藥效物質基礎研究與臨床療效脫節的瓶頸，形成4項遞進的創新性關鍵技術：①基于代謝組學的證候生物標記物發現技術；②基于證候生物標記物的方劑臨床療效評價技術；③基于中藥血清藥物化學的方劑體內顯效成分鑒定技術；④血清中外源性方劑顯效成分與內源性證候生物標記物關聯度分析技術。中醫方證代謝組學研究方法的開發將極大地促進廣泛應用，如揭示藥物作用機制、有效性和安全性。
中醫方證代謝組學應用于中醫證候生物學實質、中藥/方劑臨床療效評價、藥效物質基礎發現等領域，用以解決與中藥有效性相關的上市藥品有效性再評價，方劑配伍規律，基于臨床經驗的新藥創制，中藥質量標志物的發現及中藥材、飲片、中成藥的質量控制等科學技術問題。應用中醫方證代謝組學作為技術手段必須滿足以下條件：① 證候的中醫診斷必須準確，避免兼證；② 證候相關動物模型制備必須采用學術界認可的制備方法；③ 方劑/中藥的效應評價必須將證候要素、臨床化學與證候標記物整合分析；④ 內源性及外源性體內成分分析必須采用無歧視的全成分分析，并利用高分辨液相質譜、液相-核磁、氣相-質譜等聯用設備；⑤ 內源性標記物與外源性方劑成分關聯度分析必須多途徑進行，并進行生物學驗證。
四、創新和優勢
中醫方證代謝組學反映了中藥臨床給藥形式以及中醫方證相應的特殊性。基于此，中醫方證代謝組學闡明了體內有效物質。眾所周知，同一中藥在不同方劑中于體內表達不同的有效成分，因此必須以方劑為研究對象，闡明方劑有效性是發現藥效物質基礎的前提。該方法不同于直接分析體內組分和體外篩選生物活性物質的研究方法，它使用反向研究策略來揭示藥效物質基礎。首先，該方法探索了中醫證候/疾病的生物學本質，建立中藥療效評價體系；基于方劑有效性，評價證候/疾病治療的整體療效，解析有效性作用機制，分析效應成分，并對體內成分和證候生物標志物動態變化進行相關性分析，關聯成分進一步經生物學驗證以確定藥效物質基礎。
與代謝組學技術相比，中醫方證代謝組學不僅僅研究內源性代謝產物，更關注來源于方劑的藥物成分及其代謝產物。早期的中藥血清藥物化學研究中多數研究僅關注正常動物給藥后的體內成分及其代謝變化，少數研究關注疾病動物模型，但尚未將成分和藥物治療作用相關聯，忽視體內成分與證候標記物的關聯性，未能表達有效狀態下體內成分的顯效形式，研究結果與中藥臨床用藥實踐脫節。以往對方劑的效應評價僅僅采用有效的藥理學及病理學指標評價，難以體現對證候的綜合整體效應，而方證代謝組學是將證候要素、臨床化學及證候代謝標記物整合分析評價方劑的療效。天然產物研究的活性導向分離方法難以體現方劑配伍下藥物吸收過程中的相互作用和人體對藥物的作用，更不能體現多成分的協同作用，導致分離過程中活性成分丟失，難以獲得方劑表達療效的臨床實踐特征。隨著研究的不斷深入以及方法學的不斷完善，中醫方證代謝組學必將在中醫證候本質、中藥藥效評價及中藥質量控制研究中發揮更大的科學價值，促進中醫藥現代化進程及國際化發展。
五、中醫方證代謝組學應用進展
目前，生命科學研究已進入“組學”時代。生物標記物為疾病精確診斷提供了科學依據，而利用中醫方證代謝組學可實現中藥療效的客觀評價。研究表明中醫方證代謝組學在發現生物標記物及揭示效應機制等方面起到了重要作用。利用中醫方證代謝組學表征了陽黃證、腎陽虛證、腎陰虛證、心氣虛證等證候的生物標記物，闡明了相應方劑茵陳蒿湯、六味地黃丸、知柏地黃丸、腎氣丸及其他中藥材的藥效物質基礎及作用機制。
（一）茵陳蒿湯藥效物質基礎的發現
茵陳蒿湯是治療濕熱黃疸證的經典方劑。利用中醫方證代謝組學開展了茵陳蒿湯治療濕熱黃疸證的有效性研究，進而發現并確定藥效物質基礎及潛在效應靶點。表征了茵陳蒿湯的69個化學成分，鑒定了41個血中移行成分，發現了34個尿液生物標記物；利用PCMS技術將證候標記物與顯效狀態下的體內成分相關聯，發現了與效應關聯的藥效物質（圖2）。結合效應靶標預測技術發現了12個潛在治療靶點。進一步闡明了有效物質與其關鍵靶途徑之間的關系，為設計新型組合藥物提供研究基礎。
圖2 中醫方證代謝組學促進茵陳蒿湯藥效物質的發現
（二）篩選關黃柏活性化合物
中藥成分的生物學活性評價是探索藥效物質基礎的有效手段。最新研究利用中醫方證代謝組學開展關黃柏抑制前列腺癌的效應研究并探索其活性成分（圖3）。結果顯示關黃柏可以抑制22RV1人前列腺癌細胞移植腫瘤的生長[圖3（a）]。利用中醫方證代謝組學方法分析體內成分和代謝標記物，表征了關黃柏的54種化合物，發現了體內38個化合物[圖3（c）]。辨識并鑒定了血清中29個原型化合物和9個代謝物，發現了34個生物標志物與前列腺癌相關；關黃柏可將代謝標記物調整到正常水平，將代謝輪廓調節至健康狀態[圖3（b）]，分析發現了10個入血成分與整體效應高度相關[圖3（d）]。
圖3 高通量中醫方證代謝組學方法用于篩選關黃柏中的活性化合物
（三）中醫方證代謝組學發現開心散質量標記物
基于中藥質量標志物研究建立質量標準以揭示其有效性和安全性。開心散是用于治療阿爾茨海默病的經典方劑。針對其質量標志物仍不清楚的問題，采用中醫方證代謝組學技術探索開心散治療轉基因AD小鼠的有效性和潛在質量標志物。研究發現開心散可以減少腦組織Aβ1-42的沉積，并顯著地改善認知功能。分析體內生物標記物和化學成分，研究顯示開心散通過調節20個生物標記物重新平衡脂質和氨基酸代謝異常。
六、未來展望
中醫方證代謝組學促進了中藥有效物質的發現并闡明了其作用方式，為闡釋方證相應關系提供了一種新方法。越早整合最新的先進技術越能提高先導化合物選擇和優化的成功率，并有助于解釋方劑治療機制。然而，由于證候的復雜性，僅在代謝物層面進行作用機制研究仍不足以全面反映生命活動本質，在代謝標記物研究基礎上關注上游功能蛋白和基因，從而使證候生物學本質研究更深入、更具體，促使治療更精準。這樣將使方劑有效性評價和藥效物質基礎研究更具臨床應用價值。
在中醫方證代謝組學理論建立之初，已經考慮到此問題，研究實踐中也在緊緊地與蛋白組學等其他組學相結合。由于代謝組學是該理論的核心技術，所以該理論中名為“中醫方證代謝組學”，是以組學“omics”進行定義的，也是考慮給該理論留出空間，在未來引入并整合蛋白組學、轉錄組學及基因組學等理論和技術，使該理論不斷在實踐中得以完善。同時，下一步將在各種臨床常見證候患者大樣本方證代謝組學分析、病證結合患者大樣本方證代謝組學分析的基礎上，通過大數據整合分析，建立涵蓋常見中醫證候及病證結合表型的代謝輪廓及生物標記物、代謝輪廓與有效方劑、生物標記物與有效成分的軟件包，實現病證的精準診斷，在基于標記物分析的精準治療和有效物質發現方面作進一步創新。
中醫方證代謝組學提供了一種探索中醫治療效應的整合研究方法。從生命科學的角度來看，它考慮整體動物、器官組織和細胞層面的基因、蛋白和代謝網絡的整合變化，以便整體解析疾病病理機制。目前醫學科學呈現出中醫和現代醫學和而不同的發展趨勢，我們應抓住科學和技術革命的重大發展機遇，中西醫學界共同肩負逐步突破理念障礙，實現醫學科學一體化的大健康目標。
七、結論
精準醫學必將在21世紀發揮重要作用。鑒于世界各國都非常重視中醫藥發展的國際現狀，中國必須抓住機遇，滿足臨床需求，尊重中醫原創思維，汲取精準醫學理念，整合多學科知識，建立準確診斷和精確療效評價技術平臺，提高中醫的臨床療效，為中醫學和現代醫學科學提供有效的交流和溝通方式。中醫方證代謝組學是大數據時代精準醫學的重要組成部分，已被廣泛用于中醫證候的精確診斷和方劑效應評價。中醫方證代謝組學以精準生物標記物為橋梁，關聯體內成分建立效應評價體系，揭示經典方劑和證候對應關系，這有助于實現中國式的精準醫學模式。我們希望大力發展中醫方證代謝組學平臺，促進中醫基礎研究與臨床資源的深度融合，進一步增強中醫藥研發的原始創新能力。
改編原文：
Aihua Zhang, Hui Sun, Guangli Yan, Ying Han, Qiqi Zhao, Xijun Wang. Chinmedomics: A Powerful Approach Integrating Metabolomics with Serum Pharmacochemistry to Evaluate the Efficacy of Traditional Chinese Medicine[J]. Engineering,2019,5(1):60-68.
