視黃醇結合蛋白測定試劑盒（免疫比濁法）是指利用免疫比濁法（如免疫透射比濁法、膠乳增強免疫比濁法等）對人血清、血漿或尿液的視黃醇結合蛋白（Retinol-Binding Protein,下文簡稱“RBP”）進行體外定量測定的試劑盒。

一、視黃醇結合蛋白測定試劑盒（免疫比濁法）的研究要求

1.主要原材料研究

1.1主要包括主要原材料的選擇、制備、質量標準及實驗驗證研究，如抗體、膠乳顆粒等；質控品（如包含）、校準品（如包含）的原料選擇、制備、定值過程及試驗信息；校準品的溯源性文件，包括具體溯源鏈、試驗方法、數據及統計分析等詳細信息。

應明確試劑盒所用抗體的名稱及生物學來源，若抗體為自制，應輸出刺激免疫原名稱及來源（天然或重組）等信息，以及抗體制備、篩選、純化以及鑒定等詳細試驗信息。還應明確該抗體質量標準的要求（如外觀、純度、蛋白濃度、效價等）及確定依據；若抗體為外購，則應明確抗體的名稱及生物學來源、外購方名稱，輸出外購方出具的抗體性能指標及檢驗證書和該抗體技術指標。

1.2其他輔助原材料的選擇及驗證，如反應緩沖液等，應明確每一主要原輔料性能指標的要求以及確定該原輔料作為主要原輔料的依據。若為外購，應輸出每一主要原輔料的外購方名稱以及外購方出具的每一主要原輔料性能指標及檢驗證書。

1.3企業內部參考品、校準品、質控品的原料選擇、制備、定值過程、質量標準及實驗驗證研究；具體要求可參考國家標準GB/T 21415《體外診斷醫療器械 生物樣品中量的測量 校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》及行業標準YY/T 1662《生化分析儀用質控物》、YY/T 1549《生化分析儀用校準物》、YY/T 1709《體外診斷試劑用校準物測量不確定度評定》。

2.主要生產工藝及反應體系的研究

2.1主要生產工藝介紹，可以用流程圖方式表示，并標明關鍵控制點，簡要說明主要生產工藝的確定依據，如各組分制備的工藝、試劑的配方及工藝關鍵參數的確定等。開發者應采用經過驗證、能夠保證試劑盒質量的生產工藝。

2.2反應原理介紹；

2.3檢測方法的介紹：含樣本采集、校準方法和質控方法、測試步驟、結果計算等；

2.4反應體系研究：含樣本采集及處理、樣本要求（抗凝劑的選擇（如涉及）、樣本穩定性包括樣本儲存條件、儲存時間等）、樣本和試劑的用量、反應條件（波長、溫度、時間等）、校準方法、質控方法等的研究；

2.5不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述。

2.6不同樣本類型的反應條件如有差異應分別詳述。

3.性能評估研究

性能評估應至少包括試劑空白吸光度、分析靈敏度、準確度、線性、精密度、分析特異性及其他影響檢測的因素等。

3.1試劑空白吸光度

用指定的空白樣本重復測定，次數不少于2次，記錄試劑盒參數規定讀數點主波長下的吸光度值（A），結果均值應符合試劑盒技術要求性能指標的要求。

注：空白樣本可以是純化水、生理鹽水、零校準液等。

3.2分析靈敏度

可參照CLSI EP17-A對空白限（LoB）、檢出限（LoD）、定量限（LoQ）進行研究。

空白限的建立可使用檢測零濃度校準品或樣本稀釋液的方法進行。例如重復測定20次，根據測量結果的平均值（M）和標準差（SD），計算M+2SD及其對應的濃度值。

檢出限的確立可采用系列稀釋參考品的方法進行。一般使用有證參考物質進行梯度稀釋并進行至少60次檢測，95%以上的檢測結果高于空白限作為檢出限。另外，應使用最低檢出限或接近最低檢出限水平的樣本進行檢出限的驗證。

定量限應考慮總誤差（偏倚和精密度）的要求。偏倚可通過檢測已知濃度的低水平樣本進行估計，例如檢測低水平的有證參考物質。如涉及將樣本稀釋至低濃度水平，應確保稀釋液不引起基質效應，且在低濃度區間呈線性。精密度的估計可根據檢測試劑及其應用確定其影響因素，一般應至少包括重復性和日間精密度。

LoB，LoD，LoQ的研究需選擇多個樣本（空白樣本、低濃度水平樣本、已知濃度的低水平樣本），在多天內進行研究。

3.3準確度

對測量準確度的評價依次包括：與參考物質的相對偏差、方法學比對等方法，開發者可根據實際情況選擇以下方法的一項或兩項進行研究。優先采用與參考物質的比對研究。

3.3.1相對偏差

測試可用于評價常規方法的有證參考物質3次，測試結果記為（Xi），按YY/T 1584中的相對偏差計算公式分別計算相對偏差（Bi），如果3次結果都不超過±15%，即判為合格。如果大于等于2次的結果不符合，即判為不合格。如果有1次結果不符合，則應重新連續測試20次，并分別按照公式（1）計算相對偏差（Bi），如果大于或等于19次測試的結果都不超過±15%，即判為合格。

3.3.2比對試驗

用不少于40個在測定濃度范圍內不同濃度的人源樣品，采用參考測量程序或國內/國際普遍認為質量較好的已上市同類試劑作為比較測量程序，每份樣品按待測試劑盒操作方法及比對方法分別檢測。用線性回歸方法計算兩組結果的相關系數（r）及各濃度點（包括醫學決定水平處）的相對偏差或絕對偏差，結果應符合以下要求：

3.3.2.1 RBP試劑盒采用的樣本濃度至少覆蓋（10.0，120.0）mg/L區間；相關系數r≥0.975；（10.0，30.0]mg/L的區間內，絕對偏差應在±3.0mg/L范圍內；（30.0，120.0）mg/L的區間內，相對偏差應在±10.0%范圍內。

3.3.2.2 URBP試劑盒采用的樣本濃度至少覆蓋（0.2，10.0）mg/L區間；相關系數r≥0.975；（0.2，1.0]mg/L的區間內，絕對偏差應在±0.15mg/L范圍內；（1.0，10.0）mg/L的區間內，相對偏差應在±15.0%范圍內。

注：若樣本不穩定，一份樣本宜在兩個系統同時進行測定。待測系統及參考系統需可比，且滿足各自質量標準或試劑盒技術要求后，方可進行比對試驗。

3.4線性

建立試劑線性范圍所用的樣本基質應盡可能與臨床實際檢測的樣本相似，理想的樣本為分析物濃度接近預期測定上限的混合樣本，且應充分考慮多倍稀釋對樣本基質的影響。建立一種定量測定方法的線性范圍時，需在預期測定范圍內選擇7—11個濃度水平，每個濃度水平重復測定2—4次。例如將預期測定范圍加寬至130%，在此范圍內選擇更多的濃度水平，然后依據實驗結果逐漸減少數據點直至表現出線性關系，可發現最寬的線性范圍。

用接近線性范圍上限的高濃度樣本和接近線性范圍下限的低濃度樣本，混合成至少5個稀釋濃度（Xi）。用所用試劑分別測試以上樣本，每個稀釋濃度測試3次，分別求出每個稀釋濃度檢測結果的均值（Yi）。以稀釋濃度（Xi）為自變量，以測定結果均值（Yi）為因變量求出線性回歸方程。計算線性回歸的相關系數（r），結果應符合以下要求：

3.4.1 RBP試劑盒

開發者應該明確RBP試劑盒，線性至少覆蓋（10.0，120.0）mg/L區間：

a)線性相關系數r應不小于0.990；

b)（10.0，30.0]mg/L的區間內，絕對偏差應在±3.0mg/L范圍內；（30.0，120.0）mg/L的區間內，相對偏差應在±10.0%范圍內。

3.4.2 URBP試劑盒

開發者應該明確URBP試劑盒，線性至少覆蓋（0.2，10.0）mg/L區間：

a)線性相關系數r應不小于0.990；

b)（0.2，1.0]mg/L的區間內，絕對偏差應在±0.15mg/L范圍內；（1.0，10.0）mg/L的區間內，相對偏差應在±15.0%范圍內。

3.5精密度

精密度的評價包括重復性、中間精密度和再現性內容，評價時充分考慮影響精密度的條件：如操作者、測量儀器、測量程序、試劑批次（lot）、校準（校準品批次，校準周期）、運行（run）、時間、地點、環境條件（實驗室溫度、濕度、空氣質量、管理等）等。精密度研究中應至少進行重復性、日間精密度和批間差的研究。精密度研究用樣本一般為臨床實際檢測樣本或其混合物，必要時可進行稀釋、添加或采用基質合理的質控品。樣本濃度一般包括測量區間高、中、低在內的3～5個水平，應有醫學決定水平或參考區間上、下限濃度附近的樣本。精密度研究可能涉及多天、多地點檢測，應確保樣本的穩定性和一致性，可將樣本等分保存。

3.5.1重復性

在重復性條件下，用試劑盒測試不同濃度的樣本，重復測試10次，計算10次測試結果的平均值（）和標準差（S），根據YY/T 1584中的重復性計算公式得出變異系數（CV），結果均應符合變異系數（CV）不大于10%的要求。

3.5.2批間差

用3個不同批號的試劑盒分別測試不同濃度的樣本，每個批號重復測試3次，分別計算每批3次測試的均值（i=1,2,3）根據YY/T 1584中的批間差計算公式計算相對極差（R），不同濃度樣本測試結果均應符合批間相對極差（R）不大于15%的要求。

3.5.3日間精密度

在室內質控在控情況下，依據 CLSI EP5-A2文件對RBP試劑盒的日間精密度進行評價。要求由同一（組）操作員在同一環境條件中，使用同一儀器，同一方法和同一批號試劑，對同一測試樣本（通常采用校準品）每天重復測試2次，取均值記為（i），記錄20天的測試結果，根據式（1）、（2）計算日間精密度變異系數（CV），結果應符合日間精密度變異系數（CV）不大于10%的要求。

................................（1）

...................................（2）

式中：

B—日間變異估計值；

—第i天的測試結果均值；

—i天內測試結果的總均值；

CV—日間變異系數。

3.6分析特異性

3.6.1交叉反應

對易產生交叉反應的其他抗原、抗體等進行驗證，如前白蛋白、視黃醇等，交叉反應驗證物質的濃度應涵蓋人體生理及病理狀態下及臨床治療過程中可能出現的最高濃度值，可采用純品物質分別添加到健康人樣本、參考區間附近樣本中的方式進行驗證。

3.6.2干擾物質

應針對不同樣本類型，分別評價可能存在的干擾情況，干擾物質濃度的分布需覆蓋人體生理及病理狀態下可能出現的物質濃度，如無法獲得含有高濃度干擾物質的樣本，可采用純品物質分別添加到健康人樣本、醫學決定水平或參考區間上、下限附近樣本的方式進行驗證，說明樣本的制備方法及干擾實驗的評價標準，確定可接受的干擾物質濃度。一般采用至少兩個分析物水平的樣本進行評價，可為臨近醫學決定水平或參考區間上下限以及病理水平。

開發者應描述清楚抗原是否是天然抗原或重組抗原，若為天然抗原，應對前白蛋白及視黃醇是否干擾檢測進行驗證，一般不采用重組抗原進行干擾性研究。

3.6.2.1血清或血漿中的干擾物質

應評價血清或血漿樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響，如甘油三酯、膽紅素（游離、結合）、血紅蛋白、類風濕因子、抗核抗體、人抗鼠抗體（Human Antimouse Antibody，HAMA）、其他疾病相關蛋白及患者體內的異常生化代謝物等干擾因子的研究（結果應量化表示，禁用輕度、嚴重的模糊表述）。

3.6.2.2尿液中的干擾物質

尿液樣本中常見干擾物質對檢測結果的影響，如白蛋白、尿素、亞硝酸鹽、pH值的研究（結果應量化表示，禁用輕度、嚴重的模糊表述）。

3.6.3藥物影響（如適用）

常見相關治療藥物對檢測結果的影響。

3.6.4抗凝劑的影響

如果試劑盒適用樣本類型包括血漿樣本，應研究抗凝劑對檢測結果的影響。如乙二胺四乙酸鹽、肝素、枸櫞酸鹽等，結果應量化表示。應采用各種適用抗凝劑抗凝的血漿樣本分別與血清樣本進行對比實驗研究。方法為對比線性范圍內的同一個體的血清和血漿樣本，應包含參考區間上下限附近樣本進行檢測以驗證所用試劑對于血清和血漿樣本檢測結果的一致性。樣本量選擇應體現一定的統計學意義，說明樣本的制備方法及干擾實驗的評價標準，確定可接受的干擾物質極限濃度。

3.7校準品溯源、質控品定值以及性能驗證（如有）

應進行校準品詳細的賦值溯源，包括賦值試驗報告和溯源性文件等；質控品應進行詳細的定值研究。

校準品、質控品的量值溯源報告的要求，可參照GB/T 21415《體外診斷醫療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性》進行詳述。應輸出企業（工作）校準品及試劑盒配套校準品賦值及不確定度計算程序與記錄，給予質控品定值及其靶值范圍確定報告。

相關標準

校準品的研究應按照YY/T 1549 《生化分析儀用校準物》的要求進行性能驗證。

質控品的研究應按照YY/T 1662 《生化分析儀用質控物》的要求進行性能驗證。

如試劑盒中不包括校準品，應說明所適配校準品的制造商和批號，同時輸出相應的溯源信息。

3.8鉤狀（Hook）效應（如有）

說明不會產生Hook效應的濃度上限及相關研究，一般需在試劑盒說明書上明示對鉤狀效應的研究結果。

研究過程應注意基質效應影響，必要時應進行基質效應的研究。

3.9最大可稀釋倍數（如有）

如需稀釋，應注明對稀釋液的要求、最佳或最大稀釋比例，并明確相關的驗證信息。

3.10其他需注意問題

對于適用多個機型的試劑盒，應進行試劑盒說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估研究。

若包含不同的包裝規格，需對不同包裝規格之間的差異進行分析或驗證。如不同的包裝規格試劑盒間存在性能差異，需要對采用每個包裝規格試劑盒進行上述項目評估試驗信息及總結。如不同包裝規格之間不存在性能差異，需要對包裝規格之間不存在性能差異進行詳細說明，具體說明不同包裝規格之間的差別及可能產生的影響。

4.穩定性研究

穩定性研究主要涉及以下幾部分內容，所用試劑的穩定性研究、適用樣本的穩定性研究。

試劑穩定性：主要包括實時穩定性、運輸穩定性、復溶穩定性（如適用）、開瓶穩定性（包括機載穩定性）、凍融次數限制（如適用）等。對于實時穩定性研究，應給予至少3批次試劑盒在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究，并應當充分考慮試劑盒在儲存、運輸和使用過程中的不利條件，進行相應的穩定性研究。研究信息包括研究方法的確定依據、研究目的、實施方案、評價標準、研究數據和研究結論等。

樣本的穩定性：室溫保存、冷藏或冷凍條件下的有效期驗證，復溶要求驗證，適用冷凍保存的樣本應對凍融次數進行研究評價。

如試劑盒包含校準品和質控品，可參考YY/T 1549《生化分析儀用校準物》、YY/T 1662《生化分析儀用質控物》標準要求，進行相應穩定性研究。

試劑（含校準品和質控品）穩定性、樣本穩定性的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

二、視黃醇結合蛋白測定試劑盒（免疫比濁法）的風險分析

風險分析應符合YY/T 0316《醫療器械風險管理對醫療器械的應用》的要求。

風險分析應包含但不僅限于以下方面的內容：預期用途錯誤包括：設計開始時未設定預期分析物、未作適用機型驗證、未針對特定的樣本類型驗證。性能特征失效包括：精密度失效、準確度失效、非特異性、穩定性失效、測量范圍失效、定量失效、量值溯源失效、校準失效。不正確的結果包括：配方錯誤、采購的原料未能達到設計要求的性能、原材料儲存條件不正確、使用了過期的原材料、反應體系不正確、試劑與包裝材料不相容。可能的使用錯誤包括：生產者未按照生產流程操作，檢驗者未按照原料、半成品、成品檢驗標準操作，裝配過程組份、標簽、說明書等漏裝或誤裝，成品儲存或運輸不當，客戶未參照試劑盒說明書設置參數或使用。與安全性有關的特征包括：有毒化學試劑的化學污染、樣本的潛在生物污染、不可回收包裝或塑料的環境污染。

三、視黃醇結合蛋白測定試劑盒（免疫比濁法）的相關標準

GB/T 21415體外診斷醫療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性

GB/T 26124臨床化學體外診斷試劑（盒）

YY/T 1584視黃醇結合蛋白測定試劑盒（免疫比濁法）

YY/T 1584《視黃醇結合蛋白測定試劑盒（免疫比濁法）》

參考YY/T 1549《生化分析儀用校準物》

質控品參考YY/T 1662《生化分析儀用質控物》