重組抗體藥物是生物工程關(guān)鍵技術(shù)的前沿成果，在腫瘤、自身免疫、器官移植和感染性疾病的治療中均取得了顯著療效，在生物技術(shù)藥物市場(chǎng)中的比重也在迅速攀升。作為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域最成功的產(chǎn)品之一，如何通過(guò)質(zhì)量控制確?？贵w藥物的安全有效一直是本領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)。文中就重組抗體藥物質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、進(jìn)展及未來(lái)需要進(jìn)一步開展的工作作一簡(jiǎn)要綜述。

 

藥品的質(zhì)量源于設(shè)計(jì)，而非依賴終產(chǎn)品的檢測(cè)，重組抗體藥物也不例外。廣義的質(zhì)量控制包括生產(chǎn)過(guò)程控制、終產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)。抗體由兩條重鏈和輕鏈以鏈間二硫鍵形成連接，結(jié)構(gòu)復(fù)雜、相對(duì)分子質(zhì)量大，采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系制備通常含有翻譯后修飾，與原核體系制備的生物技術(shù)產(chǎn)品相比，其質(zhì)量控制難度相對(duì)較大。重組抗體藥物的生產(chǎn)過(guò)程包括工程細(xì)胞的構(gòu)建及傳代擴(kuò)增、細(xì)胞培養(yǎng)、抗體的純化、產(chǎn)品分裝保存等。因此生產(chǎn)單位需遵循藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP) 的總體要求建立質(zhì)量體系，并通過(guò)質(zhì)量保證部門對(duì)生產(chǎn)過(guò)程實(shí)施全程監(jiān)控才能確保終產(chǎn)品的安全有效。鑒于抗體藥物生產(chǎn)過(guò)程與其他生物技術(shù)藥物類似，本文未對(duì)抗體藥物生產(chǎn)的過(guò)程控制進(jìn)行闡述(相關(guān)內(nèi)容可

參見國(guó)家食品藥品監(jiān)督法規(guī)與 ICH 指導(dǎo)原則等)，而主要側(cè)重于介紹重組抗體藥物生產(chǎn)細(xì)胞、質(zhì)控用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、產(chǎn)品質(zhì)量控制方面的研究進(jìn)展。

 

Part1 生產(chǎn)細(xì)胞的質(zhì)量控制

 

重組單抗的生產(chǎn)細(xì)胞應(yīng)來(lái)自于共同的原始細(xì)胞，具有相同的遺傳和生物學(xué)特征，經(jīng)全面檢測(cè)無(wú)病源微生物污染，在特定的培養(yǎng)條件下，可以穩(wěn)定持續(xù)地表達(dá)結(jié)構(gòu)正確并具有生物學(xué)活性的抗體。

 

1 工程細(xì)胞的構(gòu)

 

首先應(yīng)清楚所采用細(xì)胞系的來(lái)源及培養(yǎng)歷史等有關(guān)背景資料，包括細(xì)胞種屬及地域來(lái)源、病原體檢測(cè)結(jié)果、最初分離培養(yǎng)和建系信息、采用的方法與原材料等。在構(gòu)建中應(yīng)說(shuō)明構(gòu)建和篩選的手段與步驟、克隆基因的序列、插入載體目的基因編碼區(qū)和相關(guān)側(cè)翼序列，說(shuō)明載體引入細(xì)胞的方法及載體在細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)與拷貝數(shù)，并應(yīng)提供宿主和載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性資料。同時(shí)還應(yīng)明確細(xì)胞的生長(zhǎng)特征、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)液組成、導(dǎo)入目的基因的表達(dá)水平等。

 

2 細(xì)胞庫(kù)的建立

 

細(xì)胞庫(kù)的建立可為重組抗體藥物提供質(zhì)量穩(wěn)定以及能持續(xù)傳代的細(xì)胞種子，從而確?？贵w藥物生產(chǎn)的批間一致。與其他生物技術(shù)藥物的要求類似，抗體生產(chǎn)的細(xì)胞庫(kù)為三級(jí)管理，即原始細(xì)胞庫(kù)、主細(xì)胞庫(kù)及工作細(xì)胞庫(kù)。

原始細(xì)胞庫(kù)是由一個(gè)原始細(xì)胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體或經(jīng)過(guò)克隆選擇而形成的均一細(xì)胞群體。主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)則分別由原始細(xì)胞庫(kù)和主細(xì)胞庫(kù)經(jīng)傳代后均勻混合而成。其中主細(xì)胞庫(kù)最多不得超過(guò) 2 個(gè)細(xì)胞代次，同時(shí)限定工作細(xì)胞庫(kù)代次。工作庫(kù)凍存時(shí)細(xì)胞的傳代水平須確保復(fù)蘇后傳代增殖的細(xì)胞量能滿足生產(chǎn)一批制品。復(fù)蘇后細(xì)胞的傳代水平不應(yīng)超過(guò)批準(zhǔn)用于生產(chǎn)的最高限定代次。細(xì)胞庫(kù)的管理要求建立臺(tái)賬，每支細(xì)胞有明確標(biāo)記，包括名稱、代次、批號(hào)、凍存日期等。主庫(kù)和工作庫(kù)應(yīng)分別存放，非生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)與生產(chǎn)用細(xì)胞嚴(yán)格分開存放。上述各級(jí)種子庫(kù)的細(xì)胞應(yīng)按照特定的要求經(jīng)過(guò)全面檢定合格后方可使用。

 

3 細(xì)胞檢定

 

抗體藥物的生產(chǎn)細(xì)胞檢定包括鑒別、病源微生物、致瘤性等檢查，同時(shí)以基因工程技術(shù)構(gòu)建的重組抗體生產(chǎn)細(xì)胞，還應(yīng)包括特異的鑒別試驗(yàn)與細(xì)胞基質(zhì)穩(wěn)定性內(nèi)容。

 

細(xì)胞鑒別

 

細(xì)胞鑒別可通過(guò)形態(tài)、生化方法(同工酶等)、免疫學(xué)檢測(cè)(組織相容性抗原等)、遺傳學(xué)檢測(cè)(染色體核型等)、遺傳標(biāo)志檢測(cè)(DNA 指紋圖譜等)等方法，并應(yīng)采用不同方法進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)?？贵w基因或其表達(dá)產(chǎn)物可通過(guò) PCR、限制性內(nèi)切酶譜、Southern 雜交以及免疫印跡等方法進(jìn)行鑒別。建庫(kù)后應(yīng)對(duì)主庫(kù)和生產(chǎn)終末細(xì)胞進(jìn)行全檢，同時(shí)新建的工作庫(kù)細(xì)胞也需按規(guī)定要求進(jìn)行檢定。

 

病源微生物檢測(cè)

 

該項(xiàng)檢測(cè)包括無(wú)菌、支原體、細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查。其中病毒檢測(cè)的種類及方法須根據(jù)細(xì)胞的種屬來(lái)源及細(xì)胞特性決定。通常病毒因子可通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察、紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)、不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法及接種動(dòng)物和雞胚法檢測(cè)，其中，《中華人民共和國(guó)藥典》2010 年版三部中新增規(guī)定:用不同細(xì)胞傳代培養(yǎng)法檢測(cè)病毒因子時(shí)，應(yīng)設(shè)立可觀察細(xì)胞病變的病毒陽(yáng)性對(duì)照及血吸附陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于重組工程細(xì)胞來(lái)說(shuō)，還應(yīng)當(dāng)對(duì)細(xì)胞裂解物或收獲液進(jìn)行外源因子檢。

對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測(cè)，可采用逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定、透射電鏡以及感染性試驗(yàn)方法。根據(jù)待檢細(xì)胞系的種屬及組織來(lái)源，還應(yīng)進(jìn)行特殊外源病毒因子的檢測(cè)。如鼠源細(xì)胞系，需檢測(cè)出血熱病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、呼腸孤病毒等;如為人源細(xì)胞系，應(yīng)檢測(cè)鼻咽癌病毒、巨細(xì)胞病毒、乙型、丙型肝炎病毒等。

 

致瘤性檢查

 

致瘤性檢查可通過(guò)裸鼠和新生小鼠體內(nèi)試驗(yàn)以及軟瓊脂克隆形成等體外方法進(jìn)行。目前重組抗體生產(chǎn)的 CHO 等細(xì)胞株已證明具有致瘤性，通常不再要求進(jìn)行該項(xiàng)檢查，但也有觀點(diǎn)認(rèn)為插入抗體等特定基因序列的重組工程細(xì)胞應(yīng)當(dāng)被視為全新細(xì)胞，須進(jìn)行致瘤性檢查，并在傳代/擴(kuò)增過(guò)程中進(jìn)行試驗(yàn)對(duì)比，觀察致瘤性特征的改變。基于安全性考慮，還需要優(yōu)化抗體藥物的純化工藝，并在終產(chǎn)品的放行中嚴(yán)格限量控制殘余 DNA 等具有潛在致瘤性風(fēng)險(xiǎn)的組分。

 

細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性

 

作為經(jīng) DNA 重組技術(shù)獲得的含有特定基因序列的重組抗體生產(chǎn)細(xì)胞，生產(chǎn)者還須具有細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性資料，包括重組細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性、目標(biāo)產(chǎn)品持續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性，以及在保存時(shí)細(xì)胞生產(chǎn)抗體產(chǎn)品能力的穩(wěn)定性等資料。

 

Part2  質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

 

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和檢測(cè)方法是抗體藥物質(zhì)量控制的兩個(gè)重要技術(shù)支撐點(diǎn)，而性質(zhì)穩(wěn)定均一的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是方法學(xué)建立中必不可少的重要因素。包括抗體在內(nèi)的生物大分子的結(jié)構(gòu)決定其功能，因此其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也包括理化對(duì)照品及活性標(biāo)準(zhǔn)品。

 

1  標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

 

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均一、穩(wěn)定至關(guān)重要。因此原料需進(jìn)行全面的質(zhì)量分析，甚至在部分關(guān)鍵質(zhì)控項(xiàng)目上的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)高于產(chǎn)品。原料的選擇應(yīng)遵循與供試品相同的原則，其配方研究要在基于不干擾測(cè)定結(jié)果的前提下，盡可能提高穩(wěn)定性。理化對(duì)照品在經(jīng)過(guò)全面的分析和鑒定后，主要在常規(guī)質(zhì)控中用于結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾的確證?；钚詷?biāo)準(zhǔn)品則通過(guò)協(xié)作標(biāo)定進(jìn)行賦值。安瓿分裝凍干后熔封的制備方式因其良好的氣密性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的首選。標(biāo)準(zhǔn)品的分裝應(yīng)在潔凈環(huán)境下進(jìn)行，在保持條件一致的前提下，于分裝前、中、后階段以相同時(shí)間間隔抽樣進(jìn)行分裝精度控制(≤1． 0% )，凍干后還應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌、水分等檢測(cè)，通常標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的殘留水分應(yīng)≤3． 0%，但該指標(biāo)與穩(wěn)定性相關(guān)，因此應(yīng)盡量降低標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中水分的殘留量。

抗體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般進(jìn)行冷藏或低溫冷凍保存，其有效期需根據(jù)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)確定。

穩(wěn)定性研究包括熱加速試驗(yàn)、期間核查及長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)。熱加速試驗(yàn)是通過(guò)在不同溫度條件下加速樣品的化學(xué)降解或物理變化，通過(guò)熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)與數(shù)學(xué)模型分析預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在既定儲(chǔ)存溫度下的活性、含量變化。長(zhǎng)期試驗(yàn)則是指在既定的保存條件下進(jìn)行的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)。為反映出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性特征的全貌，應(yīng)設(shè)定多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，如效價(jià)、純度、含量等。

 

2  理化對(duì)照品

 

正確的結(jié)構(gòu)是重組抗體發(fā)揮其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。理化對(duì)照品不僅是建立抗體藥物質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的前提和基礎(chǔ)，而且還可簡(jiǎn)化常規(guī)質(zhì)控方法，無(wú)需涉及質(zhì)譜等大型分析儀器，通過(guò)產(chǎn)品與理化對(duì)照的比對(duì)分析，即可發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)是否存在異常。理化對(duì)照品結(jié)構(gòu)的全面鑒定一般包括質(zhì)譜相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定、末端氨基酸序列測(cè)定、液質(zhì)肽圖或肽指紋圖譜分析、二硫鍵配對(duì)方式以及代表翻譯后修飾的糖基化分析等。

 

質(zhì)譜相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

 

抗體由 4 條肽鏈組成，且 Fc 段具有糖基化修飾，可直接測(cè)定完整抗體的相對(duì)分子質(zhì)量，也可以用糖苷酶切除糖基后再測(cè)定抗體蛋白部分的相對(duì)分子質(zhì)量，或者以還原劑將二硫鍵打開后分別測(cè)定抗體輕、重鏈相對(duì)分子質(zhì)量。目前質(zhì)譜相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定主要采用電噴霧離子化 ( electrospray ionization，ESI)及基質(zhì)輔助激光解析離子化(matrix-assisted la-ser desorption ionization，MALDI) 等離子源。蛋白離子化后，通過(guò)質(zhì)量分析器測(cè)定其質(zhì)荷比計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量，并與理論相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行比較，以初步驗(yàn)證抗體結(jié)構(gòu)是否正常。

 

末端氨基酸序列測(cè)定

 

末端氨基酸序列測(cè)定也是抗體一級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定的方式之一。通常 N-末端氨基酸測(cè)定以 Edman 降解法最為常用。由于抗體的特殊結(jié)構(gòu)，測(cè)序時(shí)須首先將二硫鍵還原，并以適當(dāng)?shù)姆椒▽⑤p、重鏈分離后再測(cè)定。如果抗體的 N-末端存在封閉，則需針對(duì)封閉類型，采用相應(yīng)方法去封閉后再按上述程序進(jìn)行測(cè)定。常見封閉形式及去封閉方法見表 1。

 

 

目前 C-末端氨基酸序列測(cè)定可采用酶法或化學(xué)法收集 C-末端肽后，再以 N-末端測(cè)序方法進(jìn)行;也可以直接對(duì)收集的 C-末端肽段進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。此外，還可通過(guò)質(zhì)譜儀測(cè)定被羧肽酶酶解后獲得的 C-末端長(zhǎng)短不一肽段的相對(duì)分子質(zhì)量，并根據(jù)相鄰相對(duì)分子質(zhì)量的差值確定 C-末端序列。

 

液質(zhì)肽圖或肽質(zhì)量指紋圖譜分析

 

為了進(jìn)一步鑒定重組抗體的一級(jí)結(jié)構(gòu)，可進(jìn)行液質(zhì)肽圖或肽質(zhì)量指紋圖譜分析。液質(zhì)肽圖是將抗體用蛋白酶酶解為肽段后，先經(jīng)色譜分離后再以質(zhì)譜檢測(cè)，通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果與蛋白酶酶解特性的綜合分析來(lái)確定各肽段的序列。而將酶解所得肽段直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)則稱為肽質(zhì)量指紋圖譜。液質(zhì)肽圖的優(yōu)勢(shì)在于各肽段經(jīng)過(guò)液相分離后，在質(zhì)譜相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定時(shí)相互之間的干擾較弱，但耗時(shí)較長(zhǎng);而后者則適宜高通量分析。

 

二硫鍵分析

 

IgG1 型抗體中，共有 16 條二硫鍵，正確配對(duì)的鏈內(nèi)、鏈間二硫鍵是維持重組抗體空間結(jié)構(gòu)和發(fā)揮生物學(xué)功能的重要保障。二硫鍵的確定方式可采用液質(zhì)肽圖或肽質(zhì)量指紋圖譜法。即在非還原條件下，將重組抗體直接進(jìn)行蛋白酶酶切，酶切后有些肽段仍通過(guò)二硫鍵連接在一起，通過(guò)對(duì)這些肽段進(jìn)行質(zhì)譜鑒定即可驗(yàn)證抗體的二硫鍵配對(duì)方式。為確?？贵w的完全酶解，必要時(shí)可分別采用兩種或以上的蛋白酶進(jìn)行酶切，并通過(guò)綜合分析對(duì)抗體二硫鍵配對(duì)的方式進(jìn)行鑒定。

 

糖基化分析

 

糖鏈在維持抗體正常結(jié)構(gòu)及與其他蛋白的相互作用中均發(fā)揮了重要作用，抗體 Fc 段的糖鏈改造可顯著改變其生物學(xué)活性。因此在抗體的質(zhì)量控制中，翻譯后糖基化修飾的分析是十分必要的。目前主要包括寡糖圖譜、糖基化位點(diǎn)分析及糖鏈結(jié)構(gòu)分析等。

寡糖圖譜是對(duì)重組抗體藥物中不同修飾形式的寡糖鏈所占比例的分析。即將糖苷酶從抗體上切下的糖鏈衍生、純化后，再以液相色譜分析確定各寡糖鏈所占的比例。寡糖多樣性形式的進(jìn)一步分析，可結(jié)合文獻(xiàn)資料并采用相應(yīng)的寡糖參考品進(jìn)行綜合比對(duì)。

抗體的糖基化主要有 N-糖與 O-糖兩種，位于N-糖還原端的 N-乙酰葡糖胺(GlcNAc) 與抗體中的天冬酰胺(Asn) 的酰胺氮以 β1，4 糖苷鍵相連，且糖基化位點(diǎn)處有特殊的序列子結(jié)構(gòu)“Asn-X-Ser/Thr”，其中“X”為除脯氨酸(Pro) 外的任意氨基酸，只有該序列子中的 Asn 才有可能發(fā)生 N-糖基化。O-糖雖無(wú)特殊序列子結(jié)構(gòu)，但可與抗體中絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr) 的羥基相連。糖基化位點(diǎn)

可通過(guò)切除糖鏈前、后的液質(zhì)肽圖或肽質(zhì)量指紋圖譜的方法確定，通過(guò)對(duì)圖譜中相對(duì)分子質(zhì)量的差異肽段進(jìn)行分析，即可確定糖基化位點(diǎn)。

糖鏈結(jié)構(gòu)分析目前有多種方法:可通過(guò)測(cè)定糖鏈的相對(duì)分子質(zhì)量結(jié)合已有的文獻(xiàn)資料對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);也可通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜的方法測(cè)定糖鏈結(jié)構(gòu);或結(jié)合多種糖苷酶對(duì)糖鏈進(jìn)行分步酶切測(cè)定單糖的連接方式等。

 

3  生物學(xué)活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)

 

活性測(cè)定是抗體質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。生物學(xué)活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品同樣需要遵從材料均勻、性質(zhì)穩(wěn)定的要求，同時(shí)還需要進(jìn)行準(zhǔn)確的賦值。重組抗體質(zhì)控用活性標(biāo)準(zhǔn)品的制備、穩(wěn)定性評(píng)價(jià)同上所述。通常其凍干制備過(guò)程中需要添加穩(wěn)定劑或賦形劑等輔料，但可通過(guò)提高活性成分的分裝量，并在梯度稀釋進(jìn)行活性測(cè)定前，以提高預(yù)稀釋倍數(shù)的方式將輔料對(duì)活性測(cè)定的干擾降至最低。雖然目前大多數(shù)抗體生物學(xué)活性測(cè)定是通過(guò)供試品與活性標(biāo)準(zhǔn)品 EC50值的比較確定的相對(duì)活性，即沒(méi)有對(duì)生物學(xué)活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行賦值，但如果在儲(chǔ)存過(guò)程中供試品、活性標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)活性降低的速率和趨勢(shì)一致時(shí)，以百分含量表示的相對(duì)生物學(xué)活性是無(wú)法客觀反應(yīng)樣品有效性的變化的，因此其標(biāo)準(zhǔn)品賦值可借鑒其他生物技術(shù)藥物活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的方式，即在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，將其 EC50值對(duì)應(yīng)的重量單位定義為一個(gè)生物學(xué)活性單位，并通過(guò)協(xié)作標(biāo)定研究進(jìn)行賦值。

協(xié)作標(biāo)定一般至少選擇 3 家以上實(shí)驗(yàn)室參與，被邀請(qǐng)單位需要具備相關(guān)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，不包括預(yù)試驗(yàn)在內(nèi)，每家單位應(yīng)能提供符合要求、不同日期進(jìn)行的至少 3 次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果。協(xié)作標(biāo)定需按統(tǒng)一的方法進(jìn)行，方法應(yīng)包括樣品復(fù)溶、稀釋、樣品排列順序等具體的操作步驟，按統(tǒng)一的方式計(jì)算后，借助統(tǒng)計(jì)學(xué)方法合并處理結(jié)果并對(duì)活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行賦值。

 

Part3  重組抗體產(chǎn)品的質(zhì)量控制

 

重組抗體產(chǎn)品的質(zhì)量控制根據(jù)相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求及產(chǎn)品自身特性，其原液檢定主要包括各種理化分析、活性測(cè)定、殘留雜質(zhì)分析等，成品除包括含量與活性測(cè)定外，還需要對(duì)安全性和注射劑的常規(guī)項(xiàng)目進(jìn)行質(zhì)控。

 

1 理化分析

 

結(jié)構(gòu)確證

 

抗體藥物批檢驗(yàn)的常規(guī)質(zhì)控中，針對(duì)結(jié)構(gòu)的理化分析主要包括 N-末端氨基酸序列、肽圖、糖基化分析等測(cè)定等，并通過(guò)引入已全面分析的理化對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，因此在常規(guī)批檢驗(yàn)質(zhì)控中，將簡(jiǎn)化結(jié)構(gòu)鑒定的工作量。N-末端氨基酸測(cè)定同理化對(duì)照品。在肽圖分析中，由于抗體的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、緊密，導(dǎo)致蛋白酶酶解的效果不理想，因此在蛋白酶酶解前，一般先采用化學(xué)或物理方法將抗體變性后，再以二硫蘇糖醇等還原劑打開二硫鍵，并對(duì)還原后的游離巰基進(jìn)行烷基化保護(hù)，按上述相同條件制備的樣品與理化對(duì)照品酶解將更完全，同時(shí)后續(xù)的 HPLC 分離也將獲得較理想肽圖。為避免糖鏈對(duì)肽圖測(cè)定的影響，有時(shí)還需要在酶解前先將其切除。糖基化分析根據(jù)抗體藥物自身的理化特性，結(jié)合理化對(duì)照品并通過(guò)唾液酸含量、寡糖圖譜分析等方式進(jìn)行控制，并可依據(jù)供試品唾液酸、各寡糖峰面積與對(duì)照品的相應(yīng)比例進(jìn)行判定。通過(guò) N-末端氨基酸序列、肽圖、糖基化分析等測(cè)定，結(jié)合與理化對(duì)照品的比對(duì)，可以有效確保生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定及抗體藥物的批間一致。

 

純度分析

 

抗體藥物的純度直接反應(yīng)了純化工藝水平及產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣。為避免一種檢測(cè)方法在蛋白純度檢測(cè)中的偏差，一般選用至少兩種不同原理的方法進(jìn)行檢測(cè)，以盡可能地分離相關(guān)雜質(zhì)并得到相對(duì)準(zhǔn)確的純度結(jié)果。測(cè)定抗體純度的常用方法包括 SDS-PAGE 法及毛細(xì)管電泳等方法，以及反相、分子排阻和離子交換等高效液相色譜法。還原型 SDS-PAGE電泳是較常用的方法，標(biāo)準(zhǔn)一般規(guī)定輕、重鏈條帶含量之和≥95． 0% 。液相色譜法進(jìn)行純度測(cè)定時(shí)應(yīng)選擇合適的色譜柱及流動(dòng)相，避免在分析過(guò)程中抗體蛋白沉淀掛柱;在正式分析之前應(yīng)充分平衡色譜柱并做空白對(duì)照，空白對(duì)照中應(yīng)無(wú)雜峰出現(xiàn);按面積歸一化法計(jì)算主峰面積，一般不應(yīng)低于總面積的 95． 0% 。

 

蛋白含量測(cè)定

 

蛋白含量測(cè)定目前常用的方法主要包括分光光度法、Lowry 法、Bradford 法、BCA 法、凱氏定氮法等。除凱氏定氮法以外，其余方法的原理均與蛋白結(jié)構(gòu)和氨基酸組成相關(guān)，并且所需含量測(cè)定對(duì)照品要和供試品一致。目前絕大多數(shù)重組抗體的含量測(cè)定采用的是分光光度法。其消光系數(shù)是根據(jù) Edel-hoch 研究建立的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸模型化合物在 6 mol·L－1鹽酸胍條件下，可被用于同等變性條件下對(duì)其他非折疊蛋白消光系數(shù)進(jìn)行估算的原理所確定。結(jié)合該變性消光系數(shù)，再通過(guò)與不同濃度天然蛋白、變性蛋白吸光值的校正計(jì)算即可獲得該目標(biāo)蛋白的消光系數(shù)，但該消光系數(shù)是通過(guò)模型化合物以及與變性蛋白的比對(duì)分析估算獲得。目前國(guó)外生物技術(shù)產(chǎn)品含量測(cè)定中，已多采用與供試品具有相同結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定，但均無(wú)公開的含量溯源資料。凱氏定氮通過(guò)含氮量分析進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，反應(yīng)中消耗的標(biāo)準(zhǔn)酸滴定液可溯源至恒重?zé)o水碳酸鈉的重量，因此無(wú)需其他蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可作為含量標(biāo)準(zhǔn)品溯源的方法，同時(shí)氨基酸組成分析也是可供選擇的手段之一。

 

其他理化特性分析

 

此類質(zhì)控主要包括相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等指標(biāo)。相對(duì)分子質(zhì)量也主要采用還原型 SDS-PAGE 電泳的方法，標(biāo)準(zhǔn)一般規(guī)定為理論相對(duì)分子質(zhì)量 ±10%以內(nèi)，并通過(guò)與理化對(duì)照的遷移率進(jìn)行校正。等電聚焦電泳是重組抗體等電點(diǎn)測(cè)定的常用方法，其 pH 梯度主要由兩性電解質(zhì)建立。由于溶媒中存在的鹽會(huì)破壞 pH 梯度，因此可采用透析、超濾、過(guò)柱等方法進(jìn)行脫鹽。測(cè)定重組抗體的等電點(diǎn)時(shí)，由于其糖基化的不均一使抗體所帶電荷不同，測(cè)定結(jié)果中會(huì)出現(xiàn)多個(gè)電泳條帶，因此重組抗體的等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果通常為一個(gè) pH 范圍，并且應(yīng)與已全面分析的理化對(duì)照品一致。

 

2 生物學(xué)活性

 

生物學(xué)活性測(cè)定是確保重組抗體有效性的重要質(zhì)控指標(biāo)?？贵w與其特異的靶點(diǎn)結(jié)合后，通過(guò)細(xì)胞因子信號(hào)的阻斷、補(bǔ)體系統(tǒng)的活化、耦聯(lián)毒素殺傷等生物學(xué)作用發(fā)揮重組抗體的治療功效，其生物學(xué)活性測(cè)定主要是在體外建立相應(yīng)的細(xì)胞評(píng)價(jià)模型，模擬其作用機(jī)制產(chǎn)生客觀的全程量效反應(yīng)，并通過(guò)與活性標(biāo)準(zhǔn)品的比較對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)其作用機(jī)制主要分為補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒法、細(xì)胞/生長(zhǎng)因子信號(hào)通路阻斷后產(chǎn)生的殺傷活性中和或細(xì)胞增殖抑制法、報(bào)告基因測(cè)定等方法。如無(wú)法建立特異的細(xì)胞學(xué)量效反應(yīng)模型，也可以測(cè)定重組抗體與其作用靶點(diǎn)的結(jié)合能力作為其功能性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，主要測(cè)定方法包括 ELISA 法、流式細(xì)胞儀法和基于表面等離子共振技術(shù) ( surface plasmon resonance，SPR)的生物分子相互作用分析法(biomolecular in-teraction analysis，BIA)等。

 

重組抗體的生物學(xué)活性測(cè)定

 

補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒(complement depend-ent cytotoxicity，CDC)法

 

重組抗 CD20 單抗的活性測(cè)定即采用該方法。將重組抗體進(jìn)行系列稀釋后與表達(dá) CD20 的效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合，重組抗體與細(xì)胞表面抗原形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程中，使抗體空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并暴露 Fc 段的補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn);通過(guò)與補(bǔ)體的孵育及其級(jí)聯(lián)激活，完成攻膜復(fù)合物的裝配并在細(xì)胞表面打孔，最終導(dǎo)致細(xì)胞溶解。細(xì)胞染色后，以抗體濃度對(duì)吸光度作圖，并以 4 參數(shù)方程擬合曲線可得到全程反應(yīng)的“反 S 形”曲線，通過(guò)供試品與活性標(biāo)準(zhǔn)品 EC50 值的比較即可對(duì)重組抗體的相對(duì)活性進(jìn)行計(jì)算和評(píng)價(jià)。

 

信號(hào)通路阻斷法

 

細(xì)胞因子等激動(dòng)劑需要與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合、激活相應(yīng)的信號(hào)通路后才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。以此類細(xì)胞/生長(zhǎng)因子或其受體為靶點(diǎn)的重組抗體的生物學(xué)活性可基于這一特點(diǎn)建立相應(yīng)的生物學(xué)活性測(cè)定方法，主要包括殺傷中和活性或特異的細(xì)胞增殖抑制活性等。以抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 單抗為例，該重組單抗能特異識(shí)別結(jié)合 TNF-α，并通過(guò)阻斷 TNF-α與受體結(jié)合而拮抗 TNF-α 的細(xì)胞毒性，使其免受TNF-α 誘導(dǎo)的凋亡。該抗體活性測(cè)定采用對(duì) TNF-α殺傷敏感的細(xì)胞系，將抗體做系列稀釋后與 TNF-α共孵育，使抗體與 TNF-α 結(jié)合。待孵育結(jié)束后加入對(duì) TNF-α 殺傷敏感的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，未被中和的TNF-α 將與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合并誘導(dǎo)凋亡。通過(guò)對(duì)存活細(xì)胞的染色、測(cè)定其吸光度值，將抗體濃度與存活細(xì)胞的量效關(guān)系進(jìn)行 4 參數(shù)擬合后，計(jì)算其EC50，并與標(biāo)準(zhǔn)品比較后即可評(píng)價(jià)抗體的相對(duì)活性。而表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)單抗的生物學(xué)活性測(cè)定則是采用細(xì)胞增殖抑制方式，即通過(guò)特異結(jié)合并封閉表皮生長(zhǎng)因子受體，有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過(guò)供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋獲得增殖抑制的量效曲線，并計(jì)算重組抗體的生物學(xué)活性。

 

報(bào)告基因法

 

報(bào)告基因法也是通過(guò)重組抗體與相應(yīng)靶點(diǎn)結(jié)合后，測(cè)定信號(hào)通路變化效應(yīng)的活性評(píng)價(jià)方式。一般在細(xì)胞株難于獲得，以及殺傷中和或增殖抑制法產(chǎn)生量效曲線的信噪比不理想時(shí)，可基于對(duì)該通路的現(xiàn)有了解，將攜帶抗體作用靶點(diǎn)反應(yīng)元件與報(bào)告基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過(guò)重組抗體與相應(yīng)靶點(diǎn)的作用，啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)檢測(cè)重組抗體的生物學(xué)活性。如在 VEGF 單抗的活性測(cè)定中，將攜帶 VEGF 受體和螢光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞，篩選后得到穩(wěn)定攜帶上述質(zhì)粒的細(xì)胞。當(dāng) VEGF 與該重組細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后，可通過(guò)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)與相應(yīng)信號(hào)通路的作用，活化螢光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。將系列梯度稀釋的供試品與標(biāo)準(zhǔn)品與一定濃度的 VEGF 孵育后，與該重組細(xì)胞共培養(yǎng)即可獲得 VEGF 單抗的活性量效曲線。IL-1β 單抗也采用了攜帶類似報(bào)告基因的細(xì)胞株進(jìn)行活性測(cè)定。

 

重組抗體的結(jié)合活性測(cè)定

 

ELISA 法

 

競(jìng)爭(zhēng) ELISA 是最常用的重組抗體結(jié)合活性測(cè)定方法。首先將制備的可溶性抗原包被后，將系列梯度稀釋的供試品、標(biāo)準(zhǔn)品與一定濃

度的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被抗原，將抗體濃度與吸光值的量效關(guān)系進(jìn)行 4 參數(shù)擬合后，計(jì)算供試品、標(biāo)準(zhǔn)品的 EC50 值評(píng)價(jià)重組抗體的結(jié)合活性。

 

流式細(xì)胞儀法

 

該方法原理與競(jìng) 爭(zhēng)ELISA 相同，只是以帶有特異結(jié)合位點(diǎn)或膜表面標(biāo)記分子的細(xì)胞替代了包被的可溶性抗原或受體，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞率來(lái)檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的效果。該方法避免了相應(yīng)抗原的制備過(guò)程，對(duì)難于獲得可溶性抗原的重組抗體可采用該方法進(jìn)行結(jié)合活性測(cè)定，同時(shí)細(xì)胞表面抗原的空間結(jié)構(gòu)近乎于天然存在形式，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)更加客觀。

 

BIA 法

 

基于 SPR 的 BIA 法測(cè)定周期短、待測(cè)樣品消耗量少，該方法在測(cè)定抗原抗體結(jié)

合活性時(shí)無(wú)需標(biāo)記，避免了標(biāo)記對(duì)分子結(jié)構(gòu)的影響，可更加真實(shí)地反映抗原抗體的結(jié)合情況。其檢測(cè)芯片可固化可溶性的抗原和細(xì)胞，待測(cè)抗體通過(guò)微液流

系統(tǒng)流經(jīng)芯片時(shí)，一旦與固化抗原結(jié)合，芯片表面的蛋白濃度就會(huì)增加，進(jìn)而引起芯片表面液體折射率的變化而被檢測(cè)到。BIA 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)還在于能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，并測(cè)定親和常數(shù)等反應(yīng)參數(shù)。

 

3 殘留雜質(zhì)

 

重組抗體一般由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)，因此需要對(duì)制品中來(lái)自表達(dá)體系及純化過(guò)程中可能存在的外源組分進(jìn)行限量控制。根據(jù)其生產(chǎn)工藝，相關(guān)雜質(zhì)的限量控制主要包括殘余 DNA、殘余宿主細(xì)胞蛋白、殘留蛋白 A 等。其中針對(duì)宿主細(xì)胞蛋白、蛋白 A(親和純化柱的配基) 的殘留限量檢測(cè)主要采用夾心 ELISA 的方法。

傳代細(xì)胞系的 DNA 理論上具有致瘤性的潛在風(fēng)險(xiǎn)，F(xiàn)DA 將生物制品可以允許的殘余 DNA 限度規(guī)定為每劑量不超過(guò) 100 pg，我國(guó)也規(guī)定須用敏感的方法測(cè)定來(lái)源于宿主細(xì)胞(包括轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物傳代細(xì)胞)的殘余 DNA 含量，其限量規(guī)定為每劑量小于 100 pg。目前殘余 DNA 的檢測(cè)方法主要包括雜交、熒光染色、定量 PCR 等方法。雜交法主要采用地高辛等非放射性材料標(biāo)記核酸探針，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，但在實(shí)際工作中通常需要對(duì)供試品及 DNA 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行蛋白酶消化等同步處理，會(huì)造成檢測(cè)靈敏度的降低。熒光染料法采用 PicoGreen 等可特異與雙鏈 DNA 形成復(fù)合物的熒光染料，以熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線與供試品的熒光強(qiáng)度，計(jì)算DNA 殘留量。該方法簡(jiǎn)便快捷，但由于抗體藥物殘余 DNA 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)較高和檢測(cè)限的原因，熒光染色法通常不適用于抗體藥物的 DNA 殘量控制。

 

4 重組抗體藥物的成品質(zhì)控

 

重組抗體藥物的成品除含量、生物學(xué)活性及必要的理化特性檢測(cè)外，還應(yīng)該按照注射劑的要求，進(jìn)行其他常規(guī)項(xiàng)目的檢測(cè)，包括鑒別試驗(yàn)、外觀、可見異物、裝量、水分、pH 值、無(wú)菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、異常毒性檢查等，具體測(cè)定方法參見現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》及其他相關(guān)技術(shù)文件。

 

Part4  重組抗體藥物未來(lái)需要開展的工作

 

我國(guó)重組抗體藥物的質(zhì)量控制技術(shù)隨著抗體藥物研發(fā)的深入也在不斷的發(fā)展和完善。未來(lái)抗體藥物質(zhì)控仍需進(jìn)一步關(guān)注以下幾個(gè)主要方面。

 

1 生產(chǎn)細(xì)胞的質(zhì)量控制

 

目前現(xiàn)行版藥典關(guān)于細(xì)胞庫(kù)管理和檢定要求，經(jīng)多年的實(shí)踐證明可以保障重組抗體等生物技術(shù)藥物生產(chǎn)細(xì)胞株的總體質(zhì)量，但作為逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)常用方法的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)仍有待進(jìn)一步完善，即需建立均一、穩(wěn)定的 RNA 模板和逆轉(zhuǎn)錄酶活性標(biāo)準(zhǔn)品，并采用諸如定量 PCR 等方法進(jìn)行酶活性定量。

 

2 重組抗體結(jié)構(gòu)分析

 

質(zhì)譜儀、毛細(xì)管電泳儀、新型高效液相系統(tǒng)等新型儀器的應(yīng)用，可有效提升抗體質(zhì)控中結(jié)構(gòu)分析的水平。例如國(guó)外研發(fā)單位在重組抗體理化對(duì)照品充分研究、鑒定的基礎(chǔ)上，已在重組抗體肽圖的質(zhì)控中，將質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)從對(duì)翻譯后修肽段的定性分析提高為定量檢測(cè)，而由于各種條件的制約，目前我國(guó)重組抗體藥物質(zhì)控理化對(duì)照品的研究還不夠詳盡，并且質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中肽圖分析結(jié)果僅要求與對(duì)照品一致。同時(shí)重組抗體翻譯后修飾的糖鏈?zhǔn)謴?fù)雜、并且其結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能相關(guān)，因此糖基化分析十分具有挑戰(zhàn)性，因此也是抗體質(zhì)量控制的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前雖然可以采用質(zhì)譜等分析手段對(duì)唾液酸、寡糖圖譜和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析，并反映一定的糖基化信息，但目前沒(méi)有一種簡(jiǎn)便易行的方法，能快速地對(duì)糖鏈的結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的分析和鑒定。

 

3 重組抗體生物學(xué)活性檢測(cè)

 

抗體活性檢測(cè)方法因其功能各異而具有多樣性，通常于體外采用細(xì)胞評(píng)價(jià)模型模擬其作用機(jī)制產(chǎn)生量效反應(yīng)進(jìn)行，但在實(shí)際工作中，有些活性檢測(cè)周期較長(zhǎng)，步驟繁瑣、影響因素多，重復(fù)性不理想，并且有些重組抗體藥物無(wú)法找到合適的細(xì)胞株進(jìn)行活性測(cè)定，進(jìn)而采用抗體結(jié)合活性作為其功能性評(píng)價(jià)指標(biāo)。針對(duì)上述有待進(jìn)一步完善的環(huán)節(jié)，可基于對(duì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的了解，構(gòu)建相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，以期建立更加準(zhǔn)確、耐用和便捷的活性測(cè)定方法。另一方面，目前抗體生物學(xué)活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)主要是以相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品活性的百分含量體現(xiàn)的，即是一個(gè)相對(duì)生物學(xué)活性結(jié)果，如能夠借鑒其他生物學(xué)技術(shù)藥物質(zhì)控經(jīng)驗(yàn)，對(duì)重組抗體藥物的生物學(xué)活性單位進(jìn)行科學(xué)的賦值和定義，并加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性的研究，將可以更加客觀有效地評(píng)價(jià)重組抗體產(chǎn)品的有效性，同時(shí)也便于類似抗體產(chǎn)品之間的比對(duì)研究。

 

4 重組抗體殘留雜質(zhì)分析

 

在重組抗體質(zhì)控中，需要對(duì)宿主細(xì)胞蛋白、蛋白A 殘留進(jìn)行限量控制。雖然抗體生產(chǎn)中主要采用CHO 細(xì)胞和蛋白 A，但各單位細(xì)胞株、生產(chǎn)工藝均非一致，因此研發(fā)單位應(yīng)根據(jù)各自的生產(chǎn)工藝制備相應(yīng)的殘量控制對(duì)照品、抗體，并建立相應(yīng)檢測(cè)方法。如采用商用試劑盒，其專屬性、檢測(cè)限、回收率等參數(shù)需經(jīng)驗(yàn)證通過(guò)后方可使用。

由于重組抗體藥物劑量大，雜交法、熒光染色法雖然可以通過(guò)增加標(biāo)準(zhǔn)品回收率、待檢樣品中核酸富集等前處理步驟，對(duì)制品中的核酸殘量進(jìn)行控制，但由于方法的局限性仍需進(jìn)一步完善。而定量PCR 方法在特異性、靈敏度、準(zhǔn)確性方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可比較客觀地對(duì)殘余 DNA 定量，并且反映片段的相對(duì)分子質(zhì)量分布。但該方法仍需要對(duì)引物設(shè)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)品等做進(jìn)一步的優(yōu)化與規(guī)范。同時(shí)殘余DNA 的檢測(cè)也需要結(jié)合工藝驗(yàn)證來(lái)綜合控制。

 

Part5  結(jié)語(yǔ)

 

如何更加科學(xué)有效地對(duì)重組抗體藥物的質(zhì)量進(jìn)行控制，還需要結(jié)合臨床評(píng)價(jià)及上市后的安全性監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步對(duì)質(zhì)控方法學(xué)、相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開展深入研究。本文對(duì)國(guó)內(nèi)外有關(guān)重組抗體藥物的質(zhì)量控制研究進(jìn)展和亟待解決的問(wèn)題進(jìn)行綜述，旨在拋磚引玉，引發(fā)大家對(duì)相關(guān)問(wèn)題的關(guān)注和討論。志謝:感謝中國(guó)食品藥品檢定研究院重組技術(shù)產(chǎn)品室饒春明研究員對(duì)于本文提供的相關(guān)資料及修改意見。