作為一種新型治療藥物，mRNA 的大規模生產具有挑戰性，并且需要具有監管機構批準方案的生產技術。目前，大規模的mRNA 生產是通過化學、重組或基于酶的系統實現的。系統的選擇取決于正在合成的 mRNA 的特性和各自的臨床應用，如文中所述。

Part1mRNA DS 生產平臺

1RNA的化學合成

RNA 的化學合成是一個自動化的循環過程，可實現連續的RNA 合成，被認為是生產短 RNA（<100 nt）的標準且穩健的方法。該方法利用亞磷酰胺化學和固相支持促進鏈從 3 ' 末端到 5' 末端延長。然而，固相合成的主要缺點是其 100 nt 限制。較長的 RNA 只能通過使用 DNA 夾板連接平臺連接較小的 RNA 來構建，加上亞磷酰胺部分的成本，可能會阻礙該技術用于大規模生產。

2RNA的重組生產

宿主細胞（大腸桿菌）中蛋白質的重組生產是一個成熟的平臺。重組 RNA 生產遵循類似的原則：編碼目的 mRNA 的 DNA 被包裝到表達載體中，然后轉移到宿主細胞中，用于隨后合成異源 mRNA，然后是一系列下游工藝 (DSP) 步驟。然而，生產重組 RNA的局限性包括轉錄 mRNA 的 5' 和 3' 末端異質性、轉錄的 mRNA 被宿主核酸酶降解以及無法摻入化學修飾的核糖核苷酸。利用 Ponchon 和 Dardel 的技術保護轉錄的 mRNA 免受宿主機制的影響，以及使用 Jacob 等人的創新以促進高度穩定的環狀 mRNA，該領域的進步正在解決這些缺點。有一些研究認為，與化學合成和針對大規模生產的體外轉錄相比，重組 RNA 生產的成本更低。一種方法利用現有的重組蛋白生產基礎設施，允許行業轉變，以及升級已經符合良好生產規范（GMP）指南的蛋白質生產單元。

Part2RNA的酶促合成

1聚合酶鏈式反應 (PCR) 和聚合酶鏈式轉錄 (PCT)

PCR 是一種用于擴增寡核苷酸 (DNA) 的成熟方法。然而，RNA聚合酶較差的熱穩定性阻礙了通過PCR進行的RNA合成。Christopher等人開發了一種獨特的雙突變 DNA 聚合酶，能夠使用核糖核苷酸合成 RNA，同樣，Tingjian 等人報道了通過PCT 以SFM4-3（DNA 聚合酶）使用未修飾和 2'-F 修飾的 rNTP 合成RNA。修飾和工程聚合酶的發展使PCT能夠高效生產RNA；然而，修飾 DNA 聚合酶技術仍處于起步階段，需要進一步發展才能將其用于大規模 RNA 生產。

2mRNA的體外轉錄（IVT）

IVT（圖 1）被認為是大規模生產 mRNA DS 的金標準方法。IVT 依賴于源自噬菌體的 RNA 聚合酶，在修飾的 RNA 聚合酶的幫助下，使用化學修飾的三磷酸核糖核苷 (rNTP) 可實現穩健的轉錄并促進 mRNA 合成。但是，存在兩個重要的限制。首先，RNA 聚合酶需要一個序列特異性啟動子來啟動轉錄，從而防止 5' 特異性修飾。其次，由于 RNA 聚合酶的非特異性跑漏，IVT RNA 表現出轉錄 mRNA 的末端異質性。

圖 1. IVT 和 DS 純化工藝以及生產 DNA 模板的上游工藝。首字母縮略詞：IP RP HPLC = 離子對反相高效液相色譜；IEX = 離子交換層析；AC = 親和層析法；TFF = 切向流過濾。

IVT 的一個關鍵優勢是 mRNA 生產過程的工藝參數獨立于模板 DNA 的序列，允許設計一個通用的生產過程來生產任何目的 mRNA，從而有可能加快監管部門批準生產新型 DS。然而，酶、帽類似物和 rNTP 等消耗品提高了成本。此外，RNA 聚合酶極易發生氧化失活，從而導致 mRNA 產物斷裂?？偠灾?，經過必要的改進，IVT 是當前最先進的技術，可提供無細胞、經濟高效、直接且連貫的技術，實現臨床使用mRNA的大規模生產。隨著對 GMP mRNA 需求的增加，生物制造商正在經歷對生產符合 GMP 規范的 mRNA 的快速需求，Aldevron 等公司投資建設了新的 GMP 生產基地。中國在 COVID-19 mRNA 疫苗中的足跡持續增長，成為在過去兩年中注冊的 COVID-19 疫苗試驗數量最多的國家之一。為了支持 mRNA 技術在中國的快速發展，金斯瑞生物宣布在江蘇鎮江開設GMP 生產基地，這將是中國最大的商業 GMP 設施之一，此設施將使公司的產能翻倍。

Part3mRNA DS的純化

mRNA DS 的純化對于實現具有生物活性和治療性的 mRNA 至關重要。實驗室規模產生的 mRNA 可以使用 DNA 酶去除 DNA 進行純化，然后通過氯化鋰沉淀進行分離。但是，需要采用多個復雜的 DSP 步驟來大規模純化臨床級 mRNA。層析法被認為是生物制藥行業用于純化工藝的標準 DSP 方法，并因其適應性、可放大性和經濟可行性而被廣泛接受。尺寸排阻層析 (SEC)可提供對 mRNA 的穩健純化；然而，它受限于無法分離相似大小的 RNA。

同樣，離子交換層析、親和層析和離子對反相層析促進高效的大規模 RNA 純化并提高產量。切向流過濾 (TFF) 有助于去除較小的污染物并濃縮 DS，以及沉淀反應，促進 mRNA 的快速純化。盡管如此，DSP 的成本和效率在很大程度上取決于各個制造商設計的特定產品純化工藝。

Part4RNA-LNP DP 制劑的挑戰和機遇

將 RNA DS 制劑成 LNP DP 對功效至關重要，因為帶電核酸自發穿過脂質雙層進入具有生物活性的細胞質的可能性很低。目前的方法涉及通過基于乙醇沉淀的連續自組裝 LNP與水性緩沖液中的核酸混合，致使核酸包封。最初的報告并未具體說明混合方法，但通過T 形接頭混合已被認為是一種可放大的方法。為確保靜電負載，含有 RNA 的水相的 pH 值緩沖低于可電離脂質的表觀 pKa。細胞內核酸遞送的機制發生了變化：陽離子脂質復合物破壞細胞膜以使核酸進入細胞質，而含有膽固醇的可電離 LNP 通過內源性受體介導的內吞途徑進入細胞，并在酸化后介導核酸從內體釋放。這些LNP被發現在體內小干擾 RNA (siRNA) 活性方面比通過預制囊泡法產生的產品活性更強。脂質膜水合一直是生產 LNP 的傳統方法，其中使用含有核酸的水性緩沖液用于被動封裝治療藥物，這通常會導致較大的異質性囊泡 (>100 nm)，這需要下游粒徑減小方法，例如超聲處理，以減小囊泡尺寸。缺乏控制、再現性以及要求額外的下游工藝限制了該方法的放大潛力。

近十年來，多篇文獻報道了使用微流控混合方法來制劑用于癌癥治療、蛋白質替代療法、基因編輯和 RNA 疫苗的 RNA-LNP。微流控能夠實現水相和有機相的非湍流混合，以控制自組裝。該技術已被證明可以從用于實驗室規模制劑開發的微升級別放大到升級規模，后者可與在線分析方法集成，實現集成生產車間的重要一步。從歷史上看，交錯人字形混合器 (SHM) 被廣泛使用，利用數十ml/min的典型流速，這比典型的流體動力流動聚焦裝置快一個數量級。然而，交錯的人字形結構增加了多維依賴性和實際限制，使其難以實現GMP 規范要求的吞吐量速度，這導致需要并行排列多個 SHM 混合器，以實現更高的吞吐量，同時保持相同的關鍵質量屬性，例如粒徑、PDI 和封裝效率。微流控混合器的創新引入了下一代環形混合器 (TrM)，該類混合器保留了 SHM 的非湍流平流混合，但通過增加混合器尺寸，可使單個混合器的流速達到更高的級別（200 mL/min vs. 12 mL/min），同時保持RNA-LNP 的關鍵質量屬性。這保持了與發現和臨床前規模生產的兼容性，并簡化了工藝放大。mRNA-1273 和 BNT162b2 如何生產用于臨床前和臨床開發物料的細節尚未完全公開；然而，Moderna 發表了大量利用微流控 SHM 技術和乙醇-滴納米沉淀的研究，描述 BNT162b2 的非人類靈長類動物研究的文章表明， LNP 是通過將脂質的乙醇溶液通過洗濾轉移到水性緩沖液中形成的。

Part5未來展望

1自擴增 RNA：

減少 RNA 生產負擔的平臺

與 mRNA 一樣，自擴增 RNA (saRNA) 不僅包含一個 5' 帽、一個 poly-A 尾以及5' 和 3' 非翻譯區，而且還編碼形成復制酶的非結構蛋白，以便在細胞內遞送時進行擴增。直接比較使用相同配方的 mRNA 和 saRNA 疫苗的研究有限。在 Vogel 等人和 Brito 等人的研究中，發現 saRNA 的效力至少是 mRNA 的64 倍。同樣，在直接研究 SARS-CoV-2 制劑時，我們將 mRNA 和 saRNA 與臨床前/臨床試驗中使用的相同制劑進行比較，發現 saRNA 的效力比 mRNA 高6-100 倍。

為了量化 mRNA 疫苗與 saRNA 疫苗相比的體積放大需求，假設 mRNA 和 saRNA 的 IVT 在相同體積和封裝效率下產生相同的質量產量。在顆粒生產之后，mRNA 和 saRNA假定導致相同的純化效率且產量與體積成線性關系。根據上述研究，生產 saRNA 所需的 RNA 減少了 6到 100 倍，并且由于氮/磷酸 (N/P) 比率保持不變，因此脂質減少了 6 到 100 倍。因此，在大流行的情況下，理論上有可能以相同的批量生產 6 到 100 倍的疫苗劑量，從而降低生產成本和所需時間。為了強調 saRNA 疫苗的優勢，我們比較了 Pfizer/BioNTech mRNA 疫苗和 saRNA 疫苗的體積放大要求。每劑Pfizer/BioNTech COVID-19 疫苗包含 0.3 mL，目前價格為 19.50 美元。假設人口總數為 77 億人，每人接種兩劑，總共需要 154 億劑或 450 萬升疫苗。從長遠來看，450 萬升將填滿兩個奧林匹克規模的游泳池，而我們假設效力高出 100 倍的 saRNA 疫苗只需要0.02 個奧林匹克規模的游泳池。假設生產成本（包括材料、RNA 和 LNP 生產）呈線性增長，使用Pfizer/BioNTech 的 mRNA 疫苗為整個人群接種疫苗將花費大約 1500 億美元。相比之下，使用 saRNA，它只需花費大約 15 億美元。最終，使用 saRNA 生產疫苗可能會大大降低生產和成本負擔。

2對RNA-LNP不斷演變的商業生產模式的觀點

目前，大規模、集中式生產是治療藥物開發的現狀。由于藥品生產必須符合高質量和安全標準，因此每個站點都必須具備滿足這些要求的知識、熟練的勞動力和基礎設施。隨著 RNA 的進一步發展，針對特定疾病基因型量身定制的、更加個性化藥物的趨勢也將加強。這種趨勢允許實現針對一小部分人群有效的治療，并且可以想象針對個人的治療。

此外，尤其是在大流行期間，由于封鎖可能會出現供應鏈挑戰，如由于健康問題導致的勞動力減少以及旅行限制導致全球必要藥物供應的嚴重中斷，此外，小瓶、過濾器和注射器等產品的短缺都代表了前所未有的疫苗生產需求。圖 4 所示為一張公開宣布參與生產 Moderna 和Pfizer/BioNTech 的 SARS-CoV2 mRNA 疫苗的工廠的地圖。這兩種疫苗都依賴于位于美國和歐洲大陸的不同生產網絡。由于生產僅限于這兩個地區，這些疫苗的全球供應是從相對較少的跨國灌裝站點分發的。作為回應，包括澳大利亞、加拿大、中國、新加坡、南非和韓國在內的幾個國家宣布了計劃和合作伙伴關系，以實現 mRNA 藥物的國內生產。

分散的生產方法將允許藥品生產商生產藥品，用于滿足當地或理想情況下個人的特定需求。這種被稱為精準醫療的模型將特定患者的基因和生活方式納入療法，以提高安全性和有效性，同時減少副作用。雖然目前的生產不適合區域性生產，但規模更小、分散的生產基地將允許采用更加個性化的療法開發方法。這對于基于 RNA 的藥物來說是可以實現的，其中 Kis 等人最近的一項研究表明， RNA 疫苗生產工藝可能比傳統疫苗生產工藝規模小 2 到 3 個數量級。

盡管擁有多個分散的生產基地有潛在的好處，但這種方法需要對監管框架進行重大改變。目前，安全性是根據大量試驗參與者的統計信息進行評估的。全球只有少數幾家公司獲得了生產基于 RNA 的藥物的知識和知識產權，分散模式可能會受到訓練有素的勞動力的區域可用性和知識分布的限制。此外，區域性疫苗生產中心的初始成本高于一個大型中心，因為每條生產線都需要一整套設備，包括分析、下游、灌裝能力，這些設備通常以集中模式共享。

如果沒有集中生產提供的規模經濟，分散設施可以通過生產多個 DP 來實現更經濟的模式。這種方法利用了多個 DP 通用的模塊化技術、工藝和程序，從而分攤了基礎設施、原材料、人力資源和開發的成本。mRNA 療法特別適合這種模型，因為 mRNA 核苷酸的序列可以大幅改變，同時保持 DS 的整體化學性質。圖 2 說明了如何使用共享資源生產各種 RNA DS，以產生覆蓋各種適應癥的一系列 RNA DP。

圖 2. RNA 藥物的多產品生產：示意圖說明了適用于各種 RNA 療法的典型生產過程，表明共享的工藝、技術和資源。隨著更多 RNA 療法的出現，資源和成本分攤有助于降低成本，使個體化療法更加可行?，F有或正在建設的 RNA 疫苗設施可以生產其它 RNA 藥物，從而提高其它基因和細胞療法的生產能力。

圖 2 代表了一家 RNA 藥物生產代工廠，它類似于徹底改變計算機和集成電子行業的半導體代工廠。最初，計算機處理器設計與針對特定計劃開發的專有生產工藝相關聯，生產僅限于少數制造商。通過引入采用標準化制造工藝的半導體代工廠，其適用于生產任意數量的電路設計，將芯片設計與生產能力和基礎設施分離。這種“民主化”的半導體芯片設計使無晶圓廠半導體公司引發了創新和市場競爭的爆炸式增長。RNA 藥物代工廠的概念由一次性生物反應器、微流控和在線分析能力等模塊化生產技術實現，代表著使未來 RNA 藥物的設計“民主化”的潛力。

近期的主要瓶頸。由于 COVID-19，在 SARS-CoV-2 基因組序列發表 63 天后，Moderna 進入臨床試驗，mRNA 療法更快的速度顯而易見。盡管開發過程迅速，但為了滿足全球需求，公司在疫苗的大規模生產方面遇到了挑戰。在這種情況下，獲得充足的脂質供應，以將 mRNA 遞送到體內發揮作用，將具有不小的挑戰性。例如，Pfizer-BioNTech針對 10 億人的疫苗（20 億劑疫苗）需要近 1.5 噸的總脂質，這代表了脂質大規模生產的顯著增加，以滿足全球疫苗需求。特別是，專有的可電離陽離子和 PEG 脂質具有復雜的合成步驟，需要專業的生產知識。在全球范圍內，生產脂質的地方很少，Pfizer與Croda簽訂了為期 5 年的脂質供應協議，BioNTech 與Evonik和Merck KGaA達成了協議，而 Corden Pharma 則為Moderna 供應脂質。mRNA 生產是另一個主要障礙；例如，Pfizer-BioNTech、Moderna 和 CureVac 疫苗分別需要 60 kg、200 kg和 24 kg mRNA 才能為 10 億人接種疫苗。一項關于生產 mRNA 疫苗技術經濟可行性的研究表明，疫苗的年生產量在很大程度上取決于 RNA 劑量，并舉了一個引人注目的例子：通過將劑量從 1 μg 減少到 0.1 μg，生產 80 億劑疫苗的時間可以從 2.6 個月減少到 8 天。這種劑量減少可以通過 saRNA 疫苗來實現，該種疫苗可以在比 mRNA 劑量更低的條件下提供免疫反應。

Part6總結

RNA 藥物的模塊化使該技術能夠快速開發疫苗，以對抗COVID-19 大流行。這種模塊化同樣將帶來生物制藥行業的 RNA 革命，因為疫苗技術的進步將被應用于加速其它 RNA 支持的基因和細胞療法的開發。2021 年，相關文章和臨床試驗注冊量急劇增加，對 RNA DS 和 LNP DP 生產的需求已經緊張。伴隨著這些和未來的生產挑戰，創新和新技術帶來了新的機遇。

saRNA等技術可將劑量減少多達100 倍，從而擴大現有基礎設施的生產能力，并允許以更小規模建造新的基礎設施。與目前需要在不同國家之間運輸中間體原液的分散模式相比，小規模生產有利于將 DP 生產、DS 制劑和灌裝活動整合到一個車間中。此外，行業已經建立了用于 RNA-LNP 臨床前開發的微流控技術，最近推出了下一代混合器，允許基于單個混合器的吞吐量進行放大，以適應藥物開發的所有階段。

集成生產步驟的趨勢與許多國家宣布獲得國內 RNA 藥物生產能力一致，以應對僅在少數幾個地區生產SARS-CoV-2 疫苗所造成的短缺。這些設施可以生產當地人口所需的藥物，并允許在大流行情況下快速開發和生產針對區域性變異株的疫苗。

這些更小的設施的規模經濟可以通過多產品生產模型來實現，其中用于基因沉默、蛋白質替代、疫苗和 RNA 工程細胞療法的各種 RNA DS 的序列以數字方式存儲，并按需生產。這樣的模式還將提高生產罕見病藥物的經濟性，代表著實現真正個性化 RNA 藥物未來的重要一步。