［摘要］聚山梨酯20/聚山梨酯80及泊洛沙姆188是抗體藥物制劑處方中常用的穩定劑。隨著研究及檢測技術的不斷進步，抗體藥物在放置過程中，蛋白來源的可見異物/不溶性微粒可被檢測到呈增加趨勢，其起因可能與抗體藥物制劑處方有關。本文對由制劑處方中聚山梨酯20/聚山梨酯80、泊洛沙姆引起的可見異物/不溶性微粒進行原因分析，明確現行指導原則及法規對可見異物/不溶性微粒的要求。在此基礎上，結合藥學審評實踐，淺談對抗體藥物制劑處方中的可見異物/不溶性微粒審評的基本考量，以期提高企業對此類問題的關注，并為同類產品的研發提供參考。

抗體藥物是生物制品行業發展最快的領域之一。既往抗體藥物多以靜脈滴注給藥方式為主，近年來，隨著抗體藥物質量研究的深入以及患者依從性需求的提高，注射給藥途徑逐漸趨于主流［1 － 2］。與靜脈滴注給藥相比，注射給藥需要抗體藥物在單位體積內濃度更高，這使得抗體藥物中輔料與抗體蛋白作用的概率增加，從而提高了可見異物/不溶性微粒增加的風險。

可見異物/不溶性微粒的控制是保證注射劑安全使用的一項重要指標，各國藥典對其均有要求［3］，特別是近年來，隨著全生命周期管理理念不斷深入，以 及抗體藥物研究成熟度不斷加強，聚山梨酯20(polysorbate 20，PS20)、聚山梨酯80(polysorbate 80，PS80)、泊洛沙姆188(poloxamer 188，P188) 等抗體藥物處方中常用輔料與抗體蛋白作用而導致可見異物/不溶性微粒數量發生變化的現象，以及隨之可能增加的風險已被逐漸關注。《ICH Q9 Quality Ｒisk Management》明確了質量風險評估的理念及原則，即質量風險管理是一個系統的流程，在整個產品生命周期中進行質量風險評估應該基于科學知識并最終與對患者的保護相結合［4］。本文將結合審評實踐及風險評估理念，就抗體藥物中蛋白來源的可見異物/不溶性微粒增加問題提出相關思考，為此類藥物的研發提供參考。

一、可見異物/不溶性微粒增加的原因分析

大多數蛋白都有形成聚體的傾向，抗體藥物在生產、儲存及運輸時都會伴隨緩慢的聚體形成過程，進而形成可見異物/不溶性微粒，甚至沉淀，現有技術已可以較好地解決并避免蛋白聚集的產生。本文將重點介紹由抗體藥物制劑處方中常用輔料與抗體蛋白作用引起的蛋白源性可見異物/不溶性微粒。

PS20，PS80 與 P188 具有良好的蛋白質穩定性和安全特性，目前已成為生物制品中最常用的表面活性劑［5］。然而，在過去幾年的研究中發現，由于此 2 種表面活性劑易發生化學降解，隨著時間的推移，在含有該成分的制劑中可觀察或檢測到可見或不可見蛋白性質的顆粒［6-8］。

聚山梨酯是異質的混合物，容易通過多種途徑降解，如化學水解、氧化和酶水解。不同途徑之間的降解模式有顯著的不同［9］，降解產物的種類可提示降解作用機制［10］。化學水解產生的主要降解產物為游離脂肪酸( free fatty acids，FFAs) ，但在生物制藥相關條件下不太可能發生化學水解［11-12］; 氧化的降解產物包括過氧化物、醛、酮、脂肪酸酯和游離脂肪酸，其中游離脂肪酸為次要降解產物; 酶水解被認為是在抗體藥物中聚山梨酯降解導致蛋白聚體微粒形成的根本原因。這些酶( 脂肪酶、酯酶等) 特別是宿主細胞蛋白殘留中的一種磷脂酶 B2 可以在酯鍵處裂解聚山梨酯，從而形成 FFAs 和游離的基團或多元醇，由于 FFAs 在水溶液中溶解度差，當溫度為5 ℃ 時，制劑中形成可見或不可見的顆粒，對其蛋白質的長期穩定性產生一定影響，從而影響藥品的有效期。此外，除了 FFAs 和多元醇之外，PS20 的降解產物還可以包括由高級酯降解引起的單酯，因此酶降解也可以改變溶液中殘留 PS20 的酯分布［13］。因此含聚山梨酯的單抗制劑中蛋白來源的微粒增加是否主要由溶解性較差的 FFAs 蓄積所致，還需研究者根據具體情況，深入分析及甄別。

P188 不像聚山梨酯易于降解，是可能替代聚山梨酯的表面活性劑，其可有效作用于空氣-水界面， 在各種影響因素條件( 如熱、攪拌、凍結) 下使抗體藥物穩定［14］。但在 2 ℃ ～ 8 ℃ 長期穩定性研究中，含有 P188 組分的制劑中可觀察到蛋白質與聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 相互作用形成的顆粒，該顆粒往往比純蛋白質顆粒要大，這種現象可能與蛋白質的物理化學性質及直接接觸包材有關，蛋白質與 PDMS 之間的相互作用導致含 P188 的制劑中形成微粒。Grapentin 等［15］ 的研究顯示，無 PDMS 的膠塞減少了這種粒子的形成。然而，當使用這個特殊的無 PDMS 塞子時，通過 FTIＲ 顯微鏡觀察到氟聚合物粒子。蛋白質-PDMS  粒子的形成可能是由不同的因素決定，如 P188 競爭性地吸附到PDMS 界面的能力、系統中 PDMS 的數量和類型以及蛋白質的濃度和分子性質等，目前形成蛋白質PDMS 顆粒確切的相關機制尚未明確［16］。

二、現行指導原則及法規要求

可見異物系指存在于注射劑、眼用液體制劑和無菌原料藥中，在規定條件下目視可以觀測到的不溶性物質，其粒徑或長度通常大于50 μm［17］，而肉眼不可見的非代謝性的顆粒雜質，粒徑通常小于50 μm［3］，被劃歸至不溶性微粒范疇。生物制品中的不溶性微粒可能是氣泡、硅油及蛋白質聚集產生的多聚體甚至是沉淀［18］。可見異物和不溶性微粒 2 項檢查對不溶性物質的測量范圍相互銜接，根據藥品中不溶性物質的危害程度，分別從宏觀和微觀進行必要的控制，共同構成一個完善的對不溶性物質的質控體系［3］。

通常對不溶性微粒/可見異物的檢查是按照《中華人民共和國藥典》2020 年版三部通則 0903 “不溶性微粒檢查法”及 0904“可見異物檢查法”對不溶性微粒和可見異物進行，不溶性微粒檢查通常是在可見異物符合規定之后進行［18］。

各國藥典對可見異物及不溶性微粒均有相應要求，其標準基本與我國藥典要求一致。

對于可見異物，我國藥典中明確規定供試品中不得檢出明顯可見異物( 長度或最大粒徑超過2 mm) ，生物制品注射用無菌制劑復溶體積 50 mL及以下，每支( 瓶) 中細微可見異物不能超過3個，復溶體積 50 mL 以上，每支( 瓶) 中細微可見異物不能超過5個［17］。歐洲藥典〈2．9．20〉要求目視檢查法對可見異物進行檢定，顆粒數量在每瓶5個可見顆粒，可見顆粒的測試結果將會報告為“幾乎無可見異物”［19］。

對于不溶性微粒，我國藥典要求若采用第一法(光阻法)，則標示裝量為 100 mL 以下的靜脈用注射液、靜脈注射用無菌粉末、注射用濃溶液及供注射用無菌原料藥，除另有規定外，每個供試品容器(份)中含 10 μm 及 10 μm 以上的微粒數不得過6000 粒，含 25 μm 及 25 μm 以上的微粒數不得過600 粒。若采用第二法(顯微計數法)，則標示裝量為 100 mL 以下的靜脈用注射液、靜脈注射用無菌粉末、注射用濃溶液及供注射用無菌原料藥，除另有規定外，每個供試品容器(份)中含 10 μm 及 10 μm 以上的微粒數不得過 3 000 粒，含 25 μm 及 25 μm 以上的微粒數不得過 300 粒。這一標準與歐洲藥典［19］是相同的。不同的是，歐洲藥典將該項目稱為 亞可見顆粒(sub-visible particle)，并規定亞可見微粒的粒徑為 10 ～ 25 μm; 我國藥典將該項目稱為不溶性微粒(particulate matter)［18］。歐洲藥典對于不溶性微粒的檢定方法及結果判定，與英國藥典與美國藥典基本一致。

此外，ICH Q4B《Test for Particulate Contamina- tion: Sub-Visible Particles General Chapter》［20］、ICH Q6B《Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological / Biological Products》［21］等國際指導原則均可作為可見異物、不溶性微粒研究分析及風險評估的依據。

目前國內外暫無專門針對由常用輔料與抗體蛋白作用引起的蛋白源性可見異物/不溶性微粒的相關指導原則或技術指南。

三、藥學評價的基本考慮

由于抗體藥物中抗原蛋白與表面活性劑作用的復雜性，隨著抗體藥物研究的深入，該類藥物放置過程中可見異物/不溶性微粒有增加的趨勢。藥物研發者應對可見異物/ 不溶性微粒增加的原因進行充分分析，明確可見異物/不溶性微粒的組成，進而進行充分的安全性評估，并確定風險控制策略。以下筆者將結合審評實踐，就上述幾方面內容進行詳細闡述。

3． 1  深入分析可見異物/不溶性微粒增加的原因

藥物研發者應基于對可見異物/不溶性微粒增加的根本原因的理解，在藥物開發早期發現并評估形成的風險，如發生概率及嚴重程度等。若在藥物開發后期階段及產品上市后階段，發現可見異物/不溶性微粒增加，應分析其形成原因及組成，如是否為單純的蛋白聚集或蛋白質-PDMS 顆粒或是溶解性差的FFAs 顆粒等。除采用藥典方法對可見異物/ 不溶性微粒進行檢定外，還可采用其他有效的蛋白、顆粒分析方法如傅立葉紅外光譜法( FT-IＲ) 、流式細胞儀 ( Flow Cam 法) 、HPLC 法及蒸發光散射檢測器法［5］等對可見異物/ 不溶性微粒結構或組成進行定性和定量分析，以明確其成分，所采用的非藥典方法應經過完善的方法學研究和驗證。同時，結合分析方法研究和驗證結果，明確如何區別工藝特征的顆粒物與新增顆粒物。

3．2 進行充分的安全性評估

當藥物放置過程中出現可見異物/不溶性微粒增加時，應及時回顧所有歷史批次樣品可見異物數據統計情況，包括長期、加 速和振蕩條件下微粒變化情況，以判斷整體變化趨 勢。通過對可見異物/不溶性微粒形成原因的深入分析，明確其是否對藥物本身質量產生影響。此外，應借鑒 ICH Q3D 指導原則［22］對元素雜質的風險評 估理念，對新增可見異物/ 不溶性微粒進行全面毒理學評估，確定其每日最大暴露量(PDE)，如有臨床數據，應結合既往臨床安全性數據評估新增可見異物/不溶性微粒的安全性。

3．3 風險防控手段

藥物研發者應遵循 ICH Q9指導原則在早期進行風險識別［4］，將可見異物/不溶性微粒列為制劑關鍵質量屬性(CQA)，建立可見異物/ 不溶性微粒風險管理方法，以評估及控制其風險。同時，在整個工藝和產品開發過程中，若識別到風險信號，如發現了微粒、聚山梨酯顯著降解或微粒形成的高風險信號，藥物研發者應展開原因調查并采取風險緩解或消除措施，以降低微粒形成的風險因素。

藥物研發者在明確新增可見異物/不溶性微粒的形成與產品本身質量發生變化無關后，可針對其特性采取風險控制措施，如增加終端過濾、縮短有效期等。對于聚山梨酯引起的可見異物/不溶性微粒增加，亦可采用敲除宿主細胞脂肪酶基因、在純化工藝中使用適當的色譜樹脂以降低聚山梨酯的酶活性水平、采用聚山梨酯替代物或開發新的表面活性劑等; 對于P188 引起的可見異物/不溶性微粒增加，可根據分子特性對P188 進行改進，亦可在整個生產過程、包裝系統中減少含硅油組件的使用等。

綜上所述，隨著質量源于設計(QbD) 理念的深入，藥物研發者在藥物的研發設計時，盡量避免出現由輔料引起的蛋白源性的可見異物/不溶性微粒風險。若在臨床試驗期間或產品上市后識別到顆粒物產生的風險信號，應首先明確可見異物/不溶性微粒增加的原因，判斷其結構及組成; 其次可根據歷史數據回顧分析結果，結合毒理學甚至臨床安全性數據對新增可見異物/不溶性微粒對藥物的安全性影響進行全面評估，基于安全性評估結果，結合分析方法研究及方法學驗證結果，制定可見異物/不溶性微粒的可接受標準及明確依據，特別是在穩定性考察中關注可見異物/不溶性微粒變化; 同時，制定有效的措施降低或消除風險，最終消除可見異物/不溶性微粒的形成。