在藥品生產的每道工序完成后，對設備進行清洗是防止藥品污染和交叉污染的必要手段，清潔的效果通常通過清潔驗證來評估，而清潔驗證效果評估則需要選用一個合適的清潔分析方法來直觀反映。常用的清潔分析方法有HPLC、TOC、UV等，本文和大家聊一聊清潔分析方法（HPLC法）驗證的關鍵點，或可供參考。

 

1.清潔分析方法驗證主要包括哪些內容呢？

 

清潔分析方法驗證主要包括了兩部分內容：

1.1對色譜分析方法驗證，通常包括專屬性、精密度、準確度、線性和范圍、定量限、檢測限、溶液穩定性。

 

1.2對采用的取樣方法的有效性和重現性進行的驗證，也就是我們常說的取樣效率或者取樣回收率。這個過程實際上是一個綜合選擇的驗證過程，包括了選擇合適的棉簽、選擇合適的擦拭溶劑、取樣人員如何操作、用棉簽取樣后用什么方式將殘留物提取出來，用什么樣的分析方法去分析樣品的全面考察。

 

2.方法驗證前準備工作中的關鍵點

 

2.1人員：選擇認真、悟性好、執行力強，最好熟悉分析方法驗證法規和流程的人員。

 

2.2驗證方案

 

（1）驗證方案要寫得詳細，專業又通俗易懂

 

（2）一定要對方案內容、驗證中的注意事項進行培訓

 

（3）驗證實施人員能夠正確理解方案，才能正確執行方案

 

2.3驗證物品

 

2.3.1對照品：最好用法定對照品，除非無法定對照品

2.3.2棉簽：

（1）能被擦拭溶劑很好的濕潤（很關鍵，關系到能否有效擦拭）

 

（2）有一定的機械強度和韌性，足以對設備表面施加一定的壓力和摩擦力，并不易脫落纖維

 

（3）與擦拭/萃取溶劑相互兼容，對檢測無干擾

 

（4）質優價量（一定要考慮公司成本）

 

（5）棉簽桿長度合適，便于折斷

 

（6）提示：經過清潔分析方法驗證選定合適的棉簽后，盡量固定生產廠家，用于后續的清潔驗證取樣。有效避免空白棉簽溶液中的棉簽導致的色譜峰大小不或位置不一的情況。

 

2.3.3取樣試管：

（1）清潔（非常重要，避免外來污染影響考察結果）

 

（2）干燥、具塞

 

（3）高度合適（與棉簽的長度匹配，便于取、放棉簽）

 

2.3.4涂布板：（因是模擬取樣，所以材質一定要與車間設備一致，最好有匹配的材質證明）

 

（1）口服制劑常用材質不銹鋼316等；

 

（2）原料藥除了不銹鋼之外，還有搪玻璃、聚四氟乙烯等材質；

 

（3）涂布板表面要平整、光滑、干凈。

 

2.3.5色譜柱、玻璃量器、儀器等：

（1）合適的色譜柱（填料、規格等），如果對于色譜柱無特殊要求，最好使用兩個不同品牌的色譜柱（考慮性能、成本和易于購買、持久供貨等）

 

（2）玻璃量器：經過校準，且在有效期內

 

（3）HPLC等：經過校準/確認，且在有效期內

 

3.各項目驗證過程中的關鍵點

 

前面說過清潔分析方法驗證實際包括了對分析方法的驗證，還有對于取樣方法和效果的驗證，老王分享過一篇《一文秒懂“清潔分析方法驗證中擦拭回收試驗”》，其中對于取樣方法和效果的驗證有詳細的描述，本文不再贅述。本文中重點聊一聊清潔分析方法驗證中針對分析方法板塊的驗證關鍵點。

 

3.1專屬性：

 

3.1.1溶液制備：通常制備4種溶液進樣，空白溶劑、空白棉簽溶液、對照品溶液、棉簽擦拭供試品溶液(100%)（模擬從車間取樣后的供試品溶液）。

3.1.2專屬性考察可接受標準：

（1）空白溶劑在待測物的保留時間處無顯著色譜峰干擾；

 

（2）空白棉簽溶液在待測物的保留時間處無顯著色譜峰干擾（如有，小于LOD也可接受. 同時建議排查是否為殘留或實驗室污染導致）

 

（3）供試品溶液中待測物的保留時間與對照品溶液中待測物的保留時間一致。

 

3.1.3專屬性中常見問題及處理

（1）空白溶劑中有API峰，干擾檢測。

對于此種情況，主要的原因可能是實驗過程中污染導致，可在實驗室將制備空白溶劑、空白棉簽的溶劑、盛放溶劑的燒杯等單獨區域放置與配制（也就是不要和對照品、供試品溶液在一個區域，不要用相同的燒杯、同一杯溶劑、同一個滴管等）防止交叉污染。

（2）空白棉簽溶液中出現棉簽導致的峰，大小不一

對于此種情況，可將棉簽提前進行預處理，例如，可以提前將取樣棉簽放入到水或擬選定的擦拭溶劑中超聲、浸泡處理，以除去干擾物。

 

3.2精密度：精密度通常用重復性、中間精密度來表征

 

3.2.1重復性：

通常制備6份100%棉簽擦拭的供試品溶液考察，6份結果的RSD≤20.0%；

精密度中供試品溶液制備示例：

取XXXX對照品約17mg，精密稱定，置100ml量瓶中，用無水乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量10ml，置20ml量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取1ml至25ml具塞試管中，取一支空白棉簽，捻住棉簽桿（注意不要接觸棉簽頭的無紡布部分）將棉簽無紡布一端插入具塞試管口中，然后用剪刀剪掉手捻過的棉簽桿部分后丟棄，在具塞試管中加入稀釋劑9ml，加塞后振搖，超聲10分鐘，放冷至室溫，即得。平行制備6份。

3.2.2中間精密度：

不同人員、不同設備、不同日期（注意并非不同時間），操作同重復性中

3.2.3精密度可接受標準：

（1）分別計算重復性6針和中間精密度6針結果的RSD

 

（2）一定計算12份結果的RSD。

 

3.2.4精密度中注意點：

（1）重復性由分析員1 做，中間精密度由分析員2 在重復性試驗序列走完后的不同日期試驗。

 

（2）重復性和中間精密度應該是完全獨立的系統，包括對照品溶液制備、流動相制備等。

 

（3）精密度考察用供試品溶液，記得一定要模擬棉簽取樣后的供試品溶液。

 

3.3準確度：

 

（1）通常制備LOQ至200%之間的溶液（濃度主要考慮可能殘留的最小量和最大量），如LOQ，100%、200%.

 

（2）每個濃度平行制備3份

 

（3）計算：回收率、回收率的RSD

 

（4）注意：準確度要模擬棉簽供試品的處理過程，具體操作可參照精密度中溶液制備。

 

3.4線性和范圍：

 

（1）溶液制備：至少5個濃度，通常涵蓋LOQ至限度200%，如LOQ（考慮殘留的最小量） 、50%、100%、150%、200%（考慮殘留可能的最大量）。

（2）可接受標準：相關系數r≥0.999。

 

3.5定量限

 

（1）常用信噪比法，用對照品溶液稀釋至信噪比大于10：1的溶液

 

（2）基線選擇注意：選擇待測物質附近基線平滑的約0.5-1min的基線即可，6針中的選擇時間應該保持一致，并且一定要是連續的6針

 

（3）注意：清潔分析方法驗證中LOQ不能超過限度的1/10（常見問題：清潔分析方法驗證中定量限大于清潔限度的1/10，可能導致一些殘留物無法被定量檢出或報告）。

 

內容延伸：驗證中可用清潔限度的1/10濃度作為定量限直接考察，節省了不斷調試濃度的工作量。在TOC等清潔分析方法中更為實用一些。

 

3.6檢測限：

 

（1）可用定量限溶液稀釋3倍，得信噪比大于3:1（注意盡量不超過10:1）。X提示：需要注意做出來的檢測限的濃度和信噪比一定要與定量限對比，是否為對應關系。

 

（2）檢測限通常3針即可，基線選擇同定量限

 

3.7溶液穩定性：

 

清潔分析方法驗證中的溶液穩定性考察，主要考慮取樣后和檢測時間中可能的間隔時間，評估貯存條件（（時間、溫度、貯存的取樣試管等）對于樣品穩定性的影響。

（1）對照品溶液：每個時間點新鮮配制對照品溶液，同時將待考察的對照品溶液進樣，計算含量（回收率）。

 

（2）供試品溶液：采用100%棉簽供試品溶液，在不同考察時間點進樣檢測。

 

溶液穩定性考察結果示例：

 

 

（1）清潔分析方法的回收率已經做了，為什么還要做擦拭回收率？4、清潔分析方法驗證中常見問題

因為這里的回收率針對的是分析方法的回收率，擦拭回收率中除了對分析方法的考察，更多的是對于棉簽選擇、擦拭方法與方式選擇、提取溶劑與方法的選擇等一個綜合考察過程。所以及時做了方法回收率（準確度），擦拭回收還是要考察的。

（2）做了擦拭回收率，是不是就不用單獨做方法回收率了？

對于這個問題，只能說不建議這樣做，因為導致擦拭回收率不合格的原因，除了分析方法還有取樣方式、擦拭力度和方法、提取溶劑選擇不合適等因素，如果你直接做擦拭回收，不做分析方法的回收率（準確度），當擦拭回收率不合格時可能不利于原因分析。

（3）已知清潔工藝中活性成分會發生降解，如何進行清潔分析方法驗證？

如果知道活性成分會在清潔工藝中發生降解，則需要在清潔分析方法開發和驗證中考慮增加主要的降解產物的控制，活性成分與降解產物加起來不超過清潔限度。

結語：以上內容為日常工作中總結的清潔分析方法驗證中的關鍵點和風險提示，或可供參考。