一、方法學驗證的目的及意義

 

1. 目的：分析方法的驗證是為了證明該分析方法與其預期目的相適應。

 

2. 需驗證的分析方法類型

① 鑒別試驗

② 雜質的定量試驗

③ 雜質控制的限度試驗

④ 原料藥或制劑中活性成分以及制劑中選定組分的定量試驗。

 

試驗類型如下：

① 鑒別試驗旨在確證樣品中的一種被測物的特性。通常將樣品的性質（如光譜、色譜行為、化學反應性等） 與參比對照品的性質進行比對。

② 雜質檢查是指樣品中雜質的定量檢測或限度檢測，兩種檢測均是為了準確反映樣品的純度。定量試驗所需驗證項目與限度試驗相比是不同的。

③ 含量測定是指測定樣品中被分析物的含量。本文件中含量測定是指原料藥中主要成分的定量測定。類似的驗證項目也適用于制劑中的活性組分或其他指定成分的定量測定，以及與其他分析方法（如溶出度）相關的定量分析。

 

3. 應清楚了解分析方法的目的，因為這將決定需要評價哪些驗證項目。應進行評價的典型的驗證項目如下：專屬性、檢測限、定量限、線性與范圍、精密度（進樣精密度、重復性、中間精密度）、準確性。

 

二、哪些情況需重新驗證

 

① 原料藥合成方法的改變

② 成品組分發生改變

③ 分析方法的改變

需要重新驗證的程度，應根據改變的情況而定。某些其他的改變可能也要求驗證。

 

 

注意：-表示該項目通常不需評價

          +表示該項目通常需評價

(1) 假如已評價重現性（見術語表），可不需再評價中間精密度；

(2) 缺乏專屬性的分析方法，應由其他分析方法來做補充；

(3) 有些情況下需要。

 

三、分析方法學驗證各項目的定義及其要求

 

1. 專屬性（Specificity）專屬性是指可能存在某些組分(如雜質、降解物、基質等)時，對被分析物準確可靠測定的能力。

 

專屬性有以下含義：

① 鑒別：確證被分析物符合其特性。

② 純度檢查：確保采用的分析方法可檢出被分析物中雜質的準確含量，如有關物質、重金屬、溶劑殘留量等。

③ 含量測定（含量或效價）：提供樣品中被分析物的含量或效價的準確結果。

專屬性注意事項：

 

 

(1) 定位分離試驗

① 主峰峰純度的確定

在專屬性驗證的相關實驗中，主成分峰都應該考察峰純度，確認主成分峰為單一成分的峰。具體做法是用DAD檢測器進行峰純度掃描或者用LC-MS確認沒有其他成分。

② 稀釋劑

應考察稀釋劑對被測物的干擾，空白稀釋劑出的峰應不干擾被測物。具體做法是按照質量標準規定的進樣量進樣空白稀釋劑，記錄色譜圖。

③ 輔料

取質量標準規定量的供試品中等量的空白輔料，按照規定分析處理，記錄色譜圖，空白輔料峰應不干擾被測物。

④ 有關物質

有關物質分為兩大塊：工藝雜質和降解雜質。如果在二者均可獲得的情況下，將雜質分別定位，并配制一份混合溶液，根據檢測內容的不同分別研究。含量測定各雜質峰應不干擾主成分的檢測，即各雜質峰應和主成分峰達成基線分離，各雜質峰之間沒有要求，重疊也無妨，因為含量測定只需確認主成分峰不受干擾即可。有關物質中各雜質峰和主成分峰之間的分離度均應符合要求，一般不小于1.5。特殊情況可將某些雜質合并控制，如互為對映異構體的非對映異構體，它們在反相色譜法中一般都是重疊的峰。

如降解雜質不可獲得，應進行酸堿氧化破壞條件下考察可能的降解雜質的干擾，該實驗一般都做，但不是必須做，如果已經對降解雜質有了充分的研究，就無需做破壞實驗。例如已經有了有效期內長期穩定性的研究結果，確認了穩定性期間的實際降解雜質。因為有些情況下，破壞實驗的結果不是真實可能的降解雜質，這種情況以雙氧水進行氧化破壞最為常見，破壞產物雜亂無章，甚至有可能因為該實驗推翻分析方法。

 

(2) 強制降解試驗

取本品分別在以下條件進行破壞降解試驗：

圖片

注意：酸、堿和雙氧水溶液濃度和放置時間均可以根據破壞情況進行調整，如某個條件有降解傾向，應調節條件使破壞至5%-20%之間。如三者均未發現降解傾向，再放置一段時間如10天，依然如此，既可說明本化合物非常穩定，穩定性期間應不會產生降解雜質。

 

 

① 峰純度

各條件下的峰純度應符合要求。

 

② 分離度

含量測定方法各破壞產物應與主成分達成基線分離，有關物質方法各破壞產物與主成分之間的分離度均應不小于1.5，各雜質之間的分離度均應不小于1.0。

 

③ 質量守恒

有關物質檢測方法需要做質量守恒的驗算，應評估主成分減少的量與雜質增加的量的一致性。理論上如主成分減少10%，雜質應增加10%，才能說明有關物質方法能準確檢出所有的降解雜質。如二者不一致，則證明方法有缺陷，或為降解雜質未檢出，或為降解雜質研究不充分，因為沒有獲得主要降解雜質的對照品，不清楚主要降解雜質的校正因子。

 

④ 質量守恒計算方法

如主成分峰在線性范圍內，可將供試品溶液的主峰峰面積和校正后的總雜質峰面積之和A除以與破壞后的溶液主峰峰面積和校正后的總雜質峰面積之和A破，其限度應在98%-102%之間。即A供/A破的值應在98%-102%之間。制定此限度的依據是藥典液相系統適用性實驗連續進樣5針，允許RSD不大于2%，也即數據2%以內的誤差可以歸屬為儀器引入。

 如主成分不在線性范圍內，則可測定供試品溶液和破壞后的溶液的主成分含量和有關物質，含量減少值除以有關物質增加值，限度應在90%-110%之間。制定這個依據源自校正因子0.9-1.1之間都可不加校正因子計算有關物質，表明雜質結果允許10%的誤差。

 以上兩個限度非官方規定，為合理限度，僅供參考，實際工作中可根據情況進行調整，本文中涉及的大部分數字都是如此。

 

⑤ 如何確定哪個降解產物需要進行鑒定？

建議在每個強制條件下降解的主要降解產物進行鑒定，一個“經驗規則”是對超過總降解產物10%的物質進行鑒定，因此，如果藥物降解10%，單個降解產物相對主藥降解3%，占總降解產物的30%，這個降解產物需鑒定，或者，如果藥物降解10%，單個降解產物相對主藥降解0.8%，僅占總降解產物的8%，這個降解產物不需鑒定，見PhRMA的“現有指導和最佳實踐”等文獻，最近PhRMA白皮書文件提出了類似方法作為確定強制降解試驗中產生的降解產物進行結構鑒定的算法，該白皮書結合ICHQ3A 和Q3B中的鑒定限給出了強制降解試驗中降解產物的鑒定限。見下表：

 

⑥ 補充說明

降解實驗可以有關物質和含量測定同時做，二者可以共用同一份破壞樣品，減少工作量，一般來說有關物質的供試品濃度大于含量測定，可以將有關物質破壞后的溶液稀釋至含量測定規定濃度。具體如何操作請讀者諸君自己設計。

 

2. 檢測限（Detectionlimit）

 

某一分析方法的檢測限度是指樣品中的被分析物能夠被檢測到的最低量，但不一定要準確定量。

檢測限注意事項：

 

 

檢測限溶液可以由母液稀釋直接考察信噪比，在2-4范圍內即可。也可由公式LOD=3.3×STEYX/斜率計算得出檢測項濃度。

 

3. 定量限（Quantitationlimit）

 

定量限度是指在合適的準確性和精密度下，能夠定量測定樣品中被分析物的最低量。它是樣品中含量低的化合物定量測定的參數，特別適用于雜質和/或降解產物的測定。

定量限注意事項：

 

 

其測定結果應具有一定的準確度和精密度。從這一概念出發，應確定信噪比為10的供試品的濃度是理所當然的。然而響應情況隨著儀器與流動相的不同而不同，在方法驗證時所選儀器與流動相得出的信噪比為10的供試品的濃度不具有普遍意義上的代表性，這只是一個偶然值。我們在實際工作中其實無需確定信噪比為10的供試品的濃度，只需證明方法需定量的限度的合理性。以下舉例說明：若方法報告限規定為0.05%，那么肯定需要證明此限度能準確定量，如不能準確定量，則此項規定不合理。我們可以稀釋制成0.01%的相應溶液，注入儀器檢測，其信噪比如大于10，則證明方法有合理的定量限。無需費時費力找出每個雜質的信噪比10的濃度，特別是已知雜質數量較多的情況下，工作量將極為巨大。直接稀釋至特定濃度考察信噪比，則非常簡單，只需將線性驗證項下的混合雜質溶液稀釋至目標濃度即可。

 

還有一種簡單的計算LOQ的方法就是根據線性驗證的結果計算，公式為LOQ=10×STEYX/斜率，STEYX為線性數據的剩余標準偏差，可以用EXCEL直接算出這個值。

 

4. 精密度（Precision）

 

分析方法的精密度指的是規定條件下對均質樣品多次取樣進行一系列檢測結果的接近程度（離散程度）。精密度可以從三個層次考慮：進樣精密度、重復性、中間精密度。分析方法的精密度通常以多次測量結果的變異性、標準偏差或變異系數來表達。

 

4.1 進樣精密度

主要用來考察儀器進樣分析的精密程度。

進樣精密度注意事項：

 

4.2 重復性（Repeatability）

重復性是指在同樣的操作條件下，在較短時間間隔的精密度：也稱為批內精密度（Intra-assayprecision）。

重復性注意事項：

 

 

4.3 中間精密度（Intermediate precision）

中間精密度是指試驗室內部條件改變，如：不同日、不同分析者、不同儀器等情況下的精密度。

中間精密度注意事項：

 

 

5. 線性與范圍（Linearity and Range）

分析方法的線性是指在給定的范圍內檢測結果與樣品中被分析物的濃度（量）成比例關系的能力。分析方法的范圍是指樣品中被分析物的較高濃度（量）和較低濃度（量）之間的一個區間，并已證實在此區間內，該方法具有合適的準確性、精密度和線性。

線性與范圍注意事項：

 

 

需要注意的是在有關物質線性驗證中，除面積歸一法之外，范圍不宜太寬，否則相關系數較差，截距較大。如果波長較小，接近流動相截止波長，則流動相本底吸收較大，則更要縮小線性驗證的范圍。每個點峰面積為供試品實際的響應值減去流動相本底值。日常工作中應該能發現在高流動相本底吸收的低濃度下響應遠小于高濃度響應除以相應稀釋倍數的值，就是由于流動相本底的影響。一般有關物質線性范圍可以是限度的20%、50%、80%、100%、120%、150%。還需注意的是線性范圍應包括準確度的三個值。

 

6. 準確度（Accuracy）

分析方法的準確性指的是真實值或認可的參考值與測量值之間相近程度。準確性有時也稱真實度。

準確度注意事項：

 

 

有關物質準確度的數據應該按照質量標準規定處理，例如質量標準規定為加校正因子的自身對照法，則應該按照質量標準的規定計算各樣品溶液的雜質含量，并計算回收率。偶見用外標法計算有關物質的回收率，而質量標準規定的是自身對照法。這背離了方法驗證的本意，方法驗證應該驗證方法自身的準確度。如果用外標法回收率合格，但線性驗證出現問題，校正因子計算不準確，導致實際工作中檢測結果偏離真實值，而方法驗證卻判斷符合要求，這明顯是不合理的。

 

7. 耐用性（Robustness）

分析方法的耐用性是指在試驗參數被故意地發生細小改變時，檢測不受影響的能力，用于說明正常使用時的可靠性。

(1) USP中關于耐用性試驗考察的條件及范圍

① 等度條件

 

 

② 梯度條件

 

 

(2) EP中關于耐用性試驗考察的條件及范圍

① 等度條件

 

 

② 梯度條件