近年來，基因毒問題是藥物開發、乃至上市后藥品質量評價的重要內容之一，甚至成為了行業內的“閃點”、“燃點”！然而，大部分同行在聊及基因毒問題時，大都僅停留在警示結構、1.5ug的概念，很少從藥理毒理的角度來思考基因毒的真正內涵。故整理此文，望共同進步。

01、什么是遺傳毒？

遺傳毒性可分為DNA損傷、基因突變、染色體結構改變和染色體數目改變四類。廣義的遺傳毒性，是指由遺傳毒物引起生物細胞基因組分子結構特異改變而使遺傳信息發生變化的有害效應；因此，通過DNA損傷產生突變以及基因組復制過程誤差率增高皆為遺傳毒性的表現。而狹義的遺傳毒性是指遺傳毒物對DNA(或染色體)的損傷作用。

02、遺傳毒理學歷史

1927年，遺傳毒理學起源于H.J.Muller的開創性工作，他的研究發現放射不僅能夠增高突變的頻率，而且誘發的突變型或表型與沒有放射時所觀察的完全一致。所以，誘發的突變反應必須根據基礎突變來評價。

1938年，Sax在Muller研究的基礎上，又研究發現X射線能夠誘發紫露草花粉顆粒中染色體結構畸變。在完全缺乏有關DNA結構和染色體組成的情況下，Sax和他的同事發現染色體內或染色體間的交換需要在核內至少有兩處大的損傷。另外發現，接觸X射線總劑量不變，但延長接觸時間，或在幾小時內分為兩部分接觸，產生染色體畸變的量降低。

1946年，Auerbach和他的同事們報道了氮芥能誘發果蠅突變，這些突變與X線誘發的突變表型是相同的，由此人們開始考慮化學物質對遺傳的作用。

到了20世紀70年代，有兩個事件使得能用誘變性資料來評價危險度。Miller和他的同事們研究發現化學致癌物能在體外和體內與DNA、RNA及蛋白質作用形成穩定的共價衍生物。    

同一時期，第二次發展改變了遺傳毒理學領域，那就是Ames（1975）和他的同事們所建立的用傷寒沙門菌進行一種簡單、廉價的突變試驗；該實驗可檢測化學物所致的組氨酸基因座的回復突變，并能結合使用一種外援性S9代謝系統。

Ames試驗于今天已被廣泛使用，而進一步同為20世紀70年代的體內微核試驗，經過幾十年的發展和應用，目前已出現使用圖像分析、流式細胞儀和激光掃描細胞儀等多種自動化系統檢測微核的方法。

再之后，1994年Gatehouse等在Mutation Research上發表了國際遺傳毒性試驗標準化研討會上制定的開展Ames試驗的一系列建議；且OECD于1997年制定了Ames試驗的指導原則，又進一步促進了該方法的標準化和應用。

而今，ICH、OECD等機構已制定并頒布多個指導原則，用于遺傳毒理學的研究，并在不斷的持續更新……

03、我國國內發布的指導原則

我國于2007年10月23日發布了《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》。在該指導原則起草過程和審評過程中一直強調：指導原則只是原則性指導，且僅能反映當時的認識！研究者不能機械地照搬指導原則，而是應充分發揮主觀能動性，積極跟蹤學科進展，推動研究工作。

2018年3月，為指導和規范藥物遺傳毒性研究，國家食品藥品監督管理總局組織修訂了《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》，且同時宣布原國家食品藥品監督管理局2007年發布的《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》廢止。

標準試驗組合

指導原則指出：根據試驗檢測的遺傳終點，可將檢測方法分為三大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷；根據試驗系統，可分為體內試驗和體外試驗。標準試驗組合應反映不同遺傳終點，包括體內和體外試驗，應包含以下內容：1）應包含細菌回復突變試驗（又稱Ames試驗），該試驗已證明能檢出相關的遺傳學改變和大部分嚙齒類動物和人類的遺傳毒性致癌劑；2）應包含哺乳動物細胞體外和/或體內試驗。

表1：國內指導原則標準試驗組合

04、ICH頒布的指導原則

1995年和1997年ICH分別頒布遺傳毒性指導原則S2A（藥物遺傳毒性試驗的特殊性指導原則）、S2B（遺傳毒性：藥物遺傳毒性試驗標準組合）；ICH遺傳毒性指導委員會于2006年6月啟動了遺傳毒性指導原則的修訂工作，并多次在美國、歐盟和日本等地召開會議商討修訂工作，最終于2011年11月正式修訂完成，完成ICH第四進程，推薦給ICH管理三方(歐盟、美國、日本)采納使用。

標準試驗組合

指導原則指出：選擇一具有更多的歷史應用經驗，部分原因是由于該組合被S2A和S2B指導原則推薦。然而，認為選擇一和選擇二同等適合的原因如下：當體外哺乳動物細胞試驗結果為陽性時，兩個實施良好的體內試驗（采用合適的組織和顯示有充分的暴露）的明確陰性結果，被認為足以證明缺乏體內遺傳毒性潛在性，因此進行兩種體內試驗的試驗策略，與對體外試驗陽性結果進行追加試驗是相同策略。

表2：ICH S2（R1）指導原則標準試驗組合

05、歷史上發生的藥品基因毒代表性事件

2007年6月，羅氏制藥在歐洲市場推出的HIV蛋白酶抑制甲磺酸奈非那韋，因為在其產品中發現一種經典的基因毒性雜質~甲基磺酸乙酯超標，EMA暫停了它在歐洲的所有市場銷售。甲磺酸乙酯的引入是由于在生產設備清洗時，乙醇未被完全烘干而殘留下來，與甲磺酸奈非那非原料藥中的甲基磺酸反應形成甲基磺酸乙酯。

甲磺酸奈非那韋化學結構

羅氏在被要求徹底解決污染問題后，還需要補充毒性研究數據，以更好的評估甲磺酸奈非那非的基因毒雜質對患者的風險。直到羅氏公司完全解決了這些問題后，EMA才恢復了甲磺酸奈非那非在歐洲市場的相關授權。在這次甲磺酸奈非那非事件發生之后，世界各國的藥品管理機構均針對基因毒性雜質提出了更加明確的規定和要求，因此，國內外醫藥企業在新藥的研發過程中也越來越重視基因毒雜質的控制和檢測。

06、小分子藥物中常見的基因毒（雜質）問題

那么，如何認識和控制基因毒雜質呢？

基因毒雜質的結構多種多樣，對于絕大多數的雜質而言，往往沒有充分的毒性或致癌研究數據，因而難以對其進行歸類。在缺乏安全性數據支持的情況下，大多數法規和指導原則采用“警示結構”作為區分普通雜質和基因毒性雜質的標志。對于含有警示結構的雜質，應當進行（Q）SAR預測和體內外遺傳毒性和致癌性研究，或者將雜質水平控制在毒理學關注閾（TTC）之下。

關于基因雜質警示結果的具體詳細信息可參考歐盟發布的警示結構《Development of structural alerts for the in vivo micro nucleus assay inrodents》，或進入The Carcinogenic Potency Database(CPDB)，里面有上千種致癌物質的列表、結構式、CAS號，作用部位，TTC值等一系列信息。

傳說中超級致癌物的虛擬結構（CNKI）

ICH最早給出了的化學原料藥雜質研究指導原則Q3A（R2）、制劑雜質研究指導原則Q3B（R2），在這些指導原則中首次提到“對于能夠產生強的藥理活性或毒性的潛在雜質，即使其含量低于0.1%，也必須進行進一步的結構鑒定”。在之后修訂的版本中，進一步明確“要關注原料藥中的潛在遺傳毒性雜質”，以及“對于毒性非常強的基因毒性雜質，需要根據實際情況來制定更低的檢測限度”，但也并未針對遺傳毒性雜質及其研究和控制問題提出明確的闡述，同時，對其研究原則、限度要求及控制策略均沒有具體的要求。

EMEA人用藥品委員會(CHMP)推出《遺傳毒性雜質限度指導原則》，引入了可接受風險的攝入量，即毒理學關注閾值（TTC）這個概念。設置了限度值TTC(1.5 μg/day)，即相當于每人每天攝入1.5 μg的基因毒性雜質，被認為對于大多數藥品來說是可以接受的風險（一生中致癌的風險小于十萬分之一）。根據此閾值，按照每日預期的攝入量去計算出該活性藥物中能夠接受的雜質水平。值得注意的是，TTC只是一個概率的方法，具有一定的風險。如果存在一個基因毒性雜質，對其毒性未知，假設其每日的攝入量在TTC范圍內，那它致癌的概率將會在10-5以下，因此限度值（TTC）不等于完全沒有風險。PS：針對不同類型的藥物，也有不同的閾值及算法。

表3：藥品中的基因毒雜質分類

07、M7指導原則~非常重要

M7于2014年6月由 ICH 指導委員會在ICH進程的第4階段中予以通過；在ICH 進程的第4階段，最后的草案被推薦給歐盟、日本和美國的監管機構采納。

M7旨在提供一個可用于致突變雜質的鑒別、分類、界定和控制的可行性框架，以限制潛在的致癌風險。同時，意在補充 ICH Q3A(R2)、Q3B(R2)和M3(R2)支持藥物進行臨床試驗和上市的非臨床安全性研究。PS：M7不適用于ICH S9范圍定義的用于晚期癌癥適應癥的原料藥和制劑。

M7再次給出了TTC、TD50、1.5μg/天等概念和數據，同時重點強調了上市后藥品變更后的基因毒雜質問題；見下表。

表4：上市后藥品變更所要面對的基因毒雜質問題

08、結語

基因毒問題，最為根本的還是安全性問題，而一個物質是否安全、是否存在基因毒，要靠試驗和數據來證明。至今，我們已經知曉了很多基因毒物質、也知道了怎么判斷警示結構，但依然出現了NDMA事件！且不論事出原因如何，結果都是藥品的質量出問題了！不過，當質量出現問題之時，作為一個藥品從業人員，反思更多的應該是問題出在了哪里？到底我們應該如何做出“安全、有效、質量可控”的藥物！

綜上，即為筆者當下理解的遺傳基因毒內容。

參考：

1. ICH 三方協調指導原則 .

2. 人用藥物遺傳毒性試驗和結果分析指導原則S2（R1）.

3. ICH.S2(R1)：Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use. 2011

4. ICH.M3 (R2): Non-clinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals. 2009

5. FDA. Guidance for industry and review staff: Recommended approaches to integration of genetic toxicology study results. 2006

6. OECD. Guideline for testing of chemicals No.471：Bacterial reverse mutation test.1997

7. OECD. Guideline for testing of chemicals No.473：InVitro mammalian chromosomal aberration test. 2016

8. OECD. Guideline for testing of chemicals No. 488：Transgenicrodent somatic and germ cell gene mutation assays. 2013

9. OECD. Guideline for testing of chemicals No. 489：Invivo mammalian alkaline comet assay. 2016

10. OECD. Guideline for testing of chemicals No. 490：Invitro mammalian cell gene mutation tests using the thymidine kinase gene. 2016

11. M7 評估和控制藥物中 DNA 反應性（致突變）雜質以限制潛在的致癌風險.

12. M7(R1)：評估和控制藥物中DNA反應性（致突變）雜質以限制潛在致癌風險.

13. 遺傳毒性雜質的警示結構.CNKI

14. http://samr.cfda.gov.cn/WS01/CL0087/226424.html

15. 書籍：《毒理學》-毒物的基礎科學