我們將具有抗氧化、抗鈣化及抗炎等多種生物學活性的天然產物原花青素（PC）與生物源性脫細胞支架材料豬小腸黏膜下層（SIS）通過交聯反應制備PC-SIS修復補片材料。PC-SIS在體外呈現出良好的生物相容性及力學穩定性；兔膀胱全層缺損修復實驗表明PC-SIS補片可有效促進膀胱平滑肌的再生，對于膀胱功能化重建意義重大。

01、研究內容簡介

交聯是提高材料力學性能及穩定性的常用工藝手段，對于SIS而言，交聯可以通過表面修飾的方法擴大其應用范圍。PC作為一種生物源性交聯劑，具有抗氧化、抗鈣化及抗炎等多種生物學功能，并且其代謝路徑及生物安全性均已被驗證。PC的酚羥基可以與膠原的酰胺羰基結合形成氫鍵，提高材料的力學穩定性。基于此，我們提出PC交聯劑的引入可以提升SIS的生物學特性，并賦予其新功能，使其更符合臨床對膀胱修復補片的要求。在本研究中，我們制備了不同交聯濃度的補片材料，在體外評價了其生物學性能，并進一步探索其作為兔膀胱全層缺損補片的應用潛能。

該研究以SIS為基底材料，應用不同濃度的PC對其進行表面修飾及改性。為了篩選合適的交聯劑濃度，在體外進行了交聯度、力學性能及生物相容性等表征及評價，結果表明0.5mg/ml（PC-SIS 1）和1mg/ml（PC-SIS 2）既可以形成有效交聯且具有良好的生物相容性 （Fig.1）。

Fig. 1 Optimal crosslinking concentration of PC in vitro. (A) Gross observation and ultrastructure of the material under a scanning electron microscope (SEM) of all groups. Scale bars = 100 μm. (B) Degree of crosslinking of PC-SIS as calculated based on the Ninhydrin assay. *P < 0.05. #P > 0.05. (C) Fourier transforms infrared spectral (FTIR) analysis. (D) Measurement of water contact angle of the materials with different concentration of crosslinker. *P < 0.05. (E) Characterization of the mechanical properties of various materials. *P < 0.05. #P > 0.05. (F) Cell proliferation in various groups as detected with a CCK-8 assay. Data was presented as mean ± S.D. *P < 0.05. #P > 0.05. (G) Viability of the cell on various materials as assessed by Calcein AM/PI staining. Scale bars = 50 μm. (H) Subcutaneous implantation of representative scaffolds 3 weeks postoperatively. ★Indicates scaffolds, →Indicates inflammatory cells. Scale bar = 50 μm.

我們進一步評價交聯材料對膀胱平滑肌細胞的生物學特性的調控效應，我們將原代提取的膀胱平滑肌細胞接種于不同交聯濃度的材料上，對其骨架形態、微觀形貌及基因表達水平進行分析表征。細胞的表觀及微觀形貌表明PC-SIS材料更利于平滑肌細胞 “簇向” 生長，且維持平滑肌細胞功能的基因表達水平顯著高于SIS組（Fig. 2）。

Fig. 2 Effect of crosslinking on R-B-SMCs. (A) F-actin staining showed the cytoskeleton on the different materials after 5 days culture. Scale bars = 50 μm. (B) SEM indicated the ultrastructure of R-B-SMCs on the different crosslinker materials after 5days culture. Scale bars = 5 μm & 10 μm. (C) Quantitative Real-Time PCR detected the smooth muscle-related gene expression on the different materials after 5 days culture. *P < 0.05.

為了進一步驗證該新型活性生物材料在膀胱組織工程中的應用潛能，我們構建了占兔膀胱總面積1/3的全層缺損修復模型，并應用不同交聯濃度的材料進行體內修復評價。術后3個月，取材后進行形態學及功能學評價，結果顯示，修復區上皮組織均可實現連續再生，且上皮功能性標記物UPK-III在各組均有表達，相較于單純SIS組，交聯材料顯著促進了平滑肌組織的再生。同時，修復區均可觀察到血管及神經的再生（Fig. 3）。膀胱尿動力學功能評價表明PC-SIS能夠顯著增強膀胱順應性（見鏈接原文）。

Fig. 3 Immunofluorescence staining and quantitative assessments of the repaired bladder domes in the sham and experimental groups at 12W after the surgery. (A) Expression of urothelial-associated markers AE1/AE3 and Uroplakin-III. UE, urothelium. Scale bars = 100 μm. (C) Expression of smooth muscle-specific markers α-SMA and Myosin. SM, smooth muscle. Scale bars = 100 μm. (E) The innervation marker, synaptophysin (SYP38). Arrows represented SYP38+. Scale bars = 50 μm. (G) The endothelial maker CD31. V denotes CD31+ vessels. Scale bars = 50 μm. Specific marker expression was indicated by red (Cy5 labeling) and DAPI staining (blue) marks the nucleus. (B, D & F) Percentage of positive area relative to total area are compared among the three groups. (B) AE1/AE3, (D) α-SMA, (F) SYP38 and (H) Number of CD31-positive vessels. Data was presented as the mean ± S.D. *P < 0.05; #P > 0.05.

PC-SIS材料具有良好的生物相容性、力學性能及抗鈣化活性。在兔膀胱全層缺損模型中，PC-SIS補片能夠有效促進平滑肌再生，改善膀胱順應性，膀胱修復后功能評價顯著優于SIS組，這種新型活性生物材料具有廣闊的臨床應用前景。期待該類生物材料可以得到深入的研究和開發，以推動動物源性脫細胞生物材料在組織修復領域的更大發展及應用。

02、論文第一/通訊作者簡介

第一作者：張秀珍

四川大學生物治療國家重點實驗室博士，生物醫學工程專業，研究方向：膀胱組織工程。

第一作者：江燕林

碩士，四川大學華西醫院干細胞與組織工程研究室助理實驗師。主要從事脫細胞基質材料制備/干細胞原代培養/病理切片及染色/動物造模等。

通訊作者：解慧琪

醫學博士，研究員，博導，四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室干細胞與組織工程研究室主任，骨科研究所副所長。主要從事細胞外基質材料與組織再生修復研究及產品轉化、成體干細胞與組織工程學研究，作為項目負責人主持完成20余項國家及省部科研項目，以第一/通訊作者發表論文60余篇。密切聯系臨床實際，專注研發具有自主知識產權的組織再生修復產品，以第一發明人申請國家發明專利30余項，授權20項，PCT專利2項。研究團隊將研究成果成功進行產業轉化，已有4項生物材料與組織工程產品獲得國家Ⅲ類醫療器械產品注冊證，已上市用于臨床惠及100余萬患者。目前尚有多個產品正在進行臨床試驗。

03、資助信息

該研究得到了國家重點研發計劃項目（No. 2017YFC1104702）等的支持。

04、原文信息

Xiu-Zhen Zhang#, Yan-Lin Jiang#, Jun-Gen Hu, Long-Mei Zhao, Qiu-Zhu Chen, Yan Liang, Yi Zhang, Xiong-Xin Lei, Rui Wang, Yi Lei, Qing-Yi Zhang, Jesse Li-Ling, Hui-Qi Xie∗. 

Procyanidins-crosslinked small intestine submucosa: A bladder patch promotes smooth muscle regeneration and bladder function restoration in a rabbit model. 

Bioactive Materials 6 (2021)1827-1838.