樣品溶劑的選擇要求，先簡(jiǎn)單的概括一下：

1、能夠溶解待測(cè)物質(zhì)；

2、不影響待測(cè)物質(zhì)檢測(cè)；

3、能夠在一定時(shí)間范圍內(nèi)保持待測(cè)物質(zhì)穩(wěn)定。

什么是溶劑效應(yīng)？

樣品溶液的溶劑強(qiáng)度強(qiáng)于流動(dòng)相溶劑強(qiáng)度時(shí)可能會(huì)造成的峰展寬、峰分叉現(xiàn)象。即色譜圖上較早洗脫的峰前沿或者開(kāi)叉，與此同時(shí)較晚洗脫的峰則較為正常的現(xiàn)象。這些現(xiàn)象可能是由以下原因引起的——樣品溶液的溶劑很可能強(qiáng)于流動(dòng)相。

可能發(fā)生溶劑效應(yīng)的情況：出峰時(shí)間早；保留弱；進(jìn)樣量大

上圖中，色譜圖上較早洗脫的峰扭曲變形或者開(kāi)叉，與此同時(shí)較晚洗脫的峰則較為尖銳與對(duì)稱(chēng)，這些現(xiàn)象顯示一個(gè)比較特殊的起因――樣品溶液的溶劑很可能強(qiáng)于流動(dòng)相。此種強(qiáng)溶劑效應(yīng)的例子在左圖中可見(jiàn)。此處的樣 品溶液的溶劑是100%乙腈(100%的強(qiáng)溶劑)，而流動(dòng)相的組成則較弱，18%的乙腈與72%的水。第一個(gè)峰是開(kāi)叉的，并且與第二個(gè)峰相比，明顯地變寬 了。當(dāng)樣品溶液的溶劑變成流動(dòng)相時(shí)，所有的峰形都改善了，且變得尖銳。見(jiàn)右圖。

為什么呢？這是因?yàn)楫?dāng)樣品進(jìn)樣時(shí)，有可能出現(xiàn)峰展寬，最佳的樣品溶液組成和體積將會(huì)保持在10%甚至更低，在這個(gè)例子里，當(dāng)樣品溶劑與流動(dòng)相溶劑強(qiáng)度不同時(shí)，換句話(huà)來(lái)說(shuō)，也就是樣品未用流動(dòng)相溶解，因此，有些樣品分子溶解在強(qiáng)溶劑中，并隨強(qiáng)溶劑流過(guò)柱子，而有些則溶解在流動(dòng)相中，從而導(dǎo)致峰分叉。

當(dāng)樣品與流動(dòng)相強(qiáng)度相差較小，進(jìn)樣影響也會(huì)小，第一個(gè)峰可能會(huì)寬于第二個(gè)峰，而當(dāng)這種展寬導(dǎo)致必要的分離度降低時(shí)，這樣情況應(yīng)引起注意，在左圖中，使用一根短柱，和5μL進(jìn)樣，這與最佳進(jìn)樣體積4μL相近，用了極性更強(qiáng)的溶劑導(dǎo)致分離度明顯的降低，從2.1降到1.5(如右圖，分離度為2或更大是評(píng)估一個(gè)完善方法的一個(gè)必要參數(shù)，也是每個(gè)方法的驗(yàn)證參數(shù)，1.5只是一個(gè)基本的分離度，任何一個(gè)方法或一根柱子都必需滿(mǎn)足這個(gè)條件，當(dāng)進(jìn)樣為一倍時(shí)，也就是10μL時(shí)，分離度更一步降低，此方法就不行了。

液相色譜系統(tǒng)的很多問(wèn)題都能在譜圖上反映出來(lái)，其中一些問(wèn)題可以通過(guò)改變?cè)O(shè)備參數(shù)得到解決，而其它的問(wèn)題必須通過(guò)修改操作程序來(lái)解決。

樣品溶劑選擇不當(dāng)?shù)慕鉀Q辦法

HPLC溶劑的要求

(1) 高純度，溶劑與固定相不互溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度要求也高。不純的溶劑會(huì)引起基線(xiàn)不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。

(2) 溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性，即足夠的溶解能力。溶劑的極性要與待測(cè)樣品相匹配，如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響純化分離，且會(huì)使柱子惡化。

(3) 溶劑要與檢測(cè)器匹配

對(duì)于UV-Vis，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒(méi)有吸收或UV 吸收很小。

(4) 化學(xué)穩(wěn)定性好

不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。

(5) 低粘度，沸點(diǎn)適中

減小溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力，降低柱壓，利于提高柱效。

常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等；粘度過(guò)低的溶劑也不宜采用，如戊烷、乙醚等，易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。

HPLC溶劑關(guān)鍵性能

(1) UV吸收性

HPLC級(jí)試劑是用特殊方法生產(chǎn)的含有最少的顆粒和最低的紫外吸收物質(zhì)，除去具有吸收UV的雜質(zhì)，在規(guī)定的波長(zhǎng)上吸光度限制在規(guī)定值以?xún)?nèi)。

(2) 梯度洗脫性能

在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。

采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度。

① 溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能作為梯度洗脫的流動(dòng)相。

當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。

② 純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來(lái)。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。

③ 防止壓力過(guò)大。

混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。

例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。

反向液相色譜

(柱效高、分離能力強(qiáng)、保留機(jī)理清楚，是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種。適用于非極性-中等極性組分)

固定相：極性小的烷基鍵合相 C8柱，C18柱

流動(dòng)相：流動(dòng)相極性 > 固定相極性 極性大的甲醇-水或乙腈-水

HPLC里面的溶劑效應(yīng)是如何產(chǎn)生的，該如何避免？如何判斷分叉的峰是否由溶劑效應(yīng)造成，第一就是通過(guò)HPLC儀器比對(duì)一下兩個(gè)劈叉峰的紫外吸收波譜，看看他們是否能完全一樣的μV特征吸收，第二將進(jìn)樣體積調(diào)節(jié)到0.1μl看看，峰是否好轉(zhuǎn)，如果滿(mǎn)足上面兩個(gè)條件幾乎就可以肯定是100%的溶劑效應(yīng)。產(chǎn)生原因：

1、樣品溶液的溶劑很可能強(qiáng)于流動(dòng)相。例如樣品溶液的溶劑是100%乙腈(100%的強(qiáng)溶劑)，而流動(dòng)相的組成則較弱，18%的乙腈與72%的水；

2、就是進(jìn)樣量比較大；

3、樣品的pH值與HPLC流動(dòng)相pH懸殊，比如酸性流動(dòng)相體系，樣品pH偏堿性(pH=10),這種情況下也很有可能發(fā)生 其實(shí)上面三個(gè)原因歸結(jié)起來(lái)就是一個(gè)原因，那就是樣品的溶劑與流動(dòng)相存在一些不一樣，當(dāng)樣品進(jìn)入流動(dòng)相的時(shí)候，由于這種巨大的差異，一部分樣品溶解進(jìn)入了流動(dòng)相，一部分還留在進(jìn)樣的溶劑里面，所以在HPLC上出現(xiàn)了保留的差異，所以要解決這個(gè)問(wèn)題的最佳方案就是，使用流動(dòng)相的起始梯度溶解樣品，如果由于溶解度的問(wèn)題，不得不改用其余的溶劑，那就只能降低進(jìn)樣體積來(lái)解決，比如 5μl，1μL。

GC-MS 測(cè)定PAHs，HP-5MS (Agilent) 柱，固相萃取后使用甲醇洗脫。用甲醇做溶劑，是否會(huì)影響柱效和柱壽命。是否是最佳選擇？甲醇的沸點(diǎn)比較高，極性比較大，如果換成正己烷類(lèi)的弱極性，低沸點(diǎn)，配合一定的色譜條件可以實(shí)現(xiàn)溶劑聚焦作用，顯著提高保留時(shí)間較短的化合物的靈敏度和檢出線(xiàn)。甲醇相對(duì)于正己烷等極性小的溶劑，造成的柱流失大，國(guó)外用乙腈做GC-MS溶劑的文獻(xiàn)很多，很多用來(lái)減少前面溶劑轉(zhuǎn)換步驟，結(jié)合大體積進(jìn)樣等，溶劑先揮發(fā)分流走掉，從而進(jìn)入柱子乙腈溶劑的較少，可認(rèn)為對(duì)柱子影響不大，同時(shí)甲醇乙腈對(duì)比，乙腈的柱流失要少。

現(xiàn)有個(gè)樣品，其結(jié)構(gòu)中只有孤立的C=O。由于樣品溶于乙醇，所以第一次做紫外掃描時(shí)就以乙醇作為溶劑。結(jié)果在202nm處測(cè)得了最大吸收。檢測(cè)該化合物的HPLC條件是以乙腈－水作為流動(dòng)相的。我用流動(dòng)相作為溶劑再對(duì)該化合物進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果在197nm處測(cè)得了最大吸收。而在200～400nm范圍內(nèi)僅在285nm處測(cè)得一很小的吸收峰。在做紫外掃描時(shí)，樣品溶劑不同，測(cè)得的樣品的最大吸收波長(zhǎng)也會(huì)不同。如果用HPLC-UV檢測(cè)該化合物，波長(zhǎng)選為202nm(以乙醇作為溶劑測(cè)得的)，是否合適呢？在做HPLC檢測(cè)時(shí)，樣品的溶劑如果不是流動(dòng)相之一，會(huì)不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果呢？C=O在270～300nm有較弱的紫外吸收(ε=10～100)，285nm的峰應(yīng)為C=O的吸收。乙腈-水的極性強(qiáng)于乙醇，由于N-π躍遷的存在，將發(fā)生藍(lán)移(最大吸收202變?yōu)?97)，在紫外區(qū)的邊緣測(cè)定有關(guān)物質(zhì)則干擾甚大，不合適；測(cè)定含量勉強(qiáng)可以，如果僅測(cè)定含量可以根據(jù)吸收情況適當(dāng)增加到210nm左右。如果溶劑跟流動(dòng)相一樣，那紫外吸收也應(yīng)該一致，否則樣品就非完全同一物質(zhì)。紫外測(cè)定選擇最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行含量測(cè)定，可以提高檢測(cè)靈敏度，減少其他干擾，但這是相對(duì)的。