藥物分析的方法學驗證所要做到的事項（一）

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    新藥申報時，藥品質量標準中分析方法必須驗證；藥物生產工藝變更、制劑的組分變更、原分析方法進行修訂時，則質量標準分析方法必須進行驗證；

    藥物分析檢驗時藥品生產的GMP的藥物分析的方法學驗證，是保證藥物分析結果準確性的前提和基礎，也是實現藥物分析檢測GMP的必然要素。

    構成藥物分析中的檢測方法驗證，這要涉及到以下些方面的內容：

 

1、分析方法驗證成功的前提條件：

（1）儀器已經確認、校正并在有效期內 

（2）經過培訓的人員

（3）可靠穩定的對照品
（4）可靠穩定的實驗試劑

（5）確認受試溶液的穩定性，在規定時間內無降解。

2、分析方法學驗證所要求驗證的內容：

（1）含量的測定 

（2）雜質的含量測定 

（3）藥物的定性鑒定 

（4）藥物的含量均勻度測定 

（5）藥物的微生物檢測 

（6）藥物的細菌內毒素的檢測

驗證內容：

準確度：

準確度是指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，用百分回收率表示。

測定回收率R（recovery）的具體方法可采用加樣回收試驗法來進行測定。加樣回收試驗已準確測定藥物含量P的真實樣品+已知量A的對照品（或標準品）測定，測定值為M。數據要求:規定的范圍內，至少用9次測定結果評價，如制備高、中、低三個不同濃度樣品各測三次。

精密度：

（重復性、中間精密度和重現性精密度是指在規定條件下，同一個均勻樣品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度。用偏差（d）、標準偏差(SD)、相對標準偏差(RSD)（變異系數，CV）表示。

  （1）重復性(repeatability):在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結果的精密度；在規定的范圍內，至少用9次測定結果評價，如制備三個不同濃度樣品各測三次或把被測物濃度當作100%，至少測6次進行評價。

 （2）中間精密度同一實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備所得結果的精密度。

 （3）重現性(reproducibility)不同實驗室，不同分析人員測定結果的精密度。

 （4）數據要求：需報告SD，RSD和可信限。

專屬性： 

指有其他成分（雜質、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準確測定出被測物的特性，能反映該方法在有共存物時對供試物準確而專屬的測定能力，是指該法用于復雜樣品分析時是否受到相互干擾程度的度量。

• 通常通過分析含有加了雜質、降解產物、有關化學物質或安慰劑成分的樣品，將所獲分析結果與未加前述成分之樣品的測試結果進行比較，兩組測試結果之差即專屬性。

•鑒別反應---應能與可能共存的物質或結構相似化合物區別，不含被分析的樣品，以及結構相似或組分中的有關化合物，均應呈負反應。

•含量測定和雜質測定---色譜法和其他方法，應附代表性圖譜，亦說明專屬性。圖中應標明各組份的位置，色譜法中的分離度應符合要求。

•雜質可獲得的情況下，對于含量測定，試樣中可加入雜質或輔料，考察測試結果是否受干擾；對于雜質測定，也可向試樣中加入一定量的雜質，考察雜質間是否得到分離。

檢測限： 

檢測限系指試樣在確定的實驗條件下，被測物能被檢測出的最低濃度或含量。它是限度檢驗效能指標，無需定量測定，只要指出高于或低于該規定濃度即可。

•非儀器分析目視法：用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。

•信噪比法:用于能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），是把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比3∶1或2∶1時的相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。

•也可采用標準差法：

空白值＝0時；

①測定背景10次以上，求出標準差σ

②將σ乘以三倍；

③在工作曲線上求出3σ相對應的濃度X，即為方法的檢出值；

空白值不等于0；

①測定背景10次以上，求出標準差σ；

②將σ乘以三倍；

③在工作曲線上求出3σ相對應的濃度X；

④將求得的對應濃度值加上空白值即得該方法的檢出限

    

定量限（limit ofquantitation LOQ）

•指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結果應具有一定準確度和精密度要求

•常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時相應的濃度或注入儀器的量進行確定，也可用儀器所測空白背景響應標準差（SD）的10倍為估計值，再經試驗確定方法的實際測定下限。

 

定量限：

指樣品中被測物能被定量測定的最低量，結果應具有一定準確度和精密度要求。

•常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時相應的濃度或注入儀器的量進行確定，也可用儀器所測空白背景響應標準差（SD）的10倍為估計值，再經試驗確定方法的實際測定下限。

 

線性：

在設計的范圍內，測試結果與試樣中被測物濃度直接呈正比關系的程度。線形通常用最小二乘法處理數據求得回歸曲線的斜率（Slope）來表示。數據要求：至少需要五個濃度考察線形，需提供相關系數、y截距（是檢定的可能偏差）、回歸斜率及方差等參數，應列出回歸方程數和線性圖。

 

注意：做線性時，應注意盡量做的點多一點、線性濃度范圍寬一點，這樣做的好處是：當你在準確度考察時，你做的回收率考察的濃度就大些，配制溶液時就容易操作些，否者，在你做線性考察時，你做的線性濃度范圍不寬，那么你在考察回收率時，你采用加入法考察時的濃度變化范圍不寬，操作濃度很難控制，造成實際操作困難。我碰到一個在做方法學研究的人，由于她在考察線性時，做的線性濃度不大，在做回收率時，加入后的量造成回收率濃度超出線性考察范圍的濃度，我說那樣是不行的。因為在做分析計算時又恰恰用了線性關系來計算，結果肯定是值得懷疑，結果是不能令人肯定的！（這是經驗總結）

范圍：

指達到一定精密度、準確度和線性的條件下，測試方法適用的高、低限濃度或量的區間。范圍應根據分析方法的具體應用和線性、準確度、精密度結果和要求確定。

•原料藥和制劑含量測定范圍為80%-120%；制劑含量均勻度范圍為70%-130%；雜質測定應為被測雜質匯報值到限度的120%；溶出度應為測定范圍的±20%，如規定了限度范圍，應為下限的-20%至上限的+20%，例如緩釋片1h<20%,7h>70%,則驗證范圍定為0-90%。

耐用性：

指測定條件稍有變動時，結果不受影響的承受程度，為常規檢驗提供依據。是衡量實驗室和工作人員之間在正常情況下實驗結果重現性的尺度;如果方法易受到分析條件的影響，或要求苛刻，應注明。典型的變動包括：分析溶液的穩定性，提取時間等。

 

藥物分析的方法學驗證事項（二） 

 

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含量測定方法驗證的接收標準

*容量分析法：用原料藥精制品(含量>99.5％)或對照品考察方法的精密度，相對標準差一般應不大于0.2％；進行回收率試驗。回收率一般在99.7～100.3％之間。

*UV法：用適當濃度的精制品進行測定，其RSD一般不大于1％。制劑的測定，回收率一般應在98％～102％之間；線性：吸光度A一般在0.2～0.7，濃度點n＝5。用濃度c對A作線性回歸處理，得一直線方程，r應達到0.9999(n＝5)，方程的截距應近于零含量測定方法驗證的接收標準。

*HPLC法：

*要求RSD<2％，回收率98％～102％之間。

*線性范圍：用精制品配制一系列標準溶液，濃度點n應為5～7，用濃度c對峰高h或被測物的響應值之比進行回歸處理，建立回歸方程，r應大于0.999，截距應趨于零。

 

分析方法驗證步驟：

*驗證方案的制訂。

*驗證目的、方法改進背景。

*提供的原料藥和產品、儀器概要、試劑、對照品。

*待驗證的方法，項目，合格標準。

*實施人員的培訓。

*參考文獻。

*驗證的實施。

*收集完整的驗證過程記錄和原始圖譜。

*復核。

*驗證報告。

*評價該方法是否通過驗證。

方法確認和方法轉移。

*對新產品的方法驗證通常在產品開發階段完成；大規模生產后的驗證通常包括方法確認和方法轉移。

*分析方法確認是指當國家標準或藥典標準擬變化或已經變化時在本實驗室進行的對所涉及產品是否適用的確認實驗。

*確認之前應對新舊方法進行核對，標明所有變更細節。

*檢驗樣品的信息（批號、規格),變更項目的接收標準。

*確認試驗的樣品通常包括正常產品、穩定性產品。

*方法轉移指檢驗方法由轉移方轉移至接收方時進行的實驗。

 *流動相PH（±0.5)。

 *流動相組成(有機相±5%）。

 *色譜柱（同一廠家的三個批號，或兩個不同廠家（同固定相和填充物，尺寸）。

 *溫度（20-25C)和流速(±10%）。

 *檢測波長(±5nm)。

檢驗項目和驗證內容總結。

*鑒別試驗除專屬性、耐用性外，其它都不要求。

*雜質的限度檢查除專屬性、檢測限、耐用性外，其它都不要求。

*雜質的定量測定除檢測限外，其它都要求。

*含量測定及溶出量測定除檢測限、定量限外，其它都要求。