獸藥殘留（animal drug residues）是指給動物使用藥物后蓄積或貯存在細胞、組織或器官內的藥物原形、代謝產物和藥物雜質。近10年來，水產品中獸藥殘留問題引起了社會的廣泛關注，也經歷了貿易壁壘的多發期，直接影響著中國水產行業的轉型和升級。在水產品養殖過程中，非法使用違禁藥物、不遵守休藥期、生物體代謝差異和不合理用藥等都有可能導致獸藥殘留超標。

獸藥殘留分析的檢測手段多樣，酶聯免疫試劑盒、膠體金免疫試紙條和熒光試紙條等快速檢測產品能夠實現高通量、快速篩選，其靈敏度、準確性和時效性正在不斷優化和革新；氣相色譜儀、液相色譜儀、氣相色譜-質譜儀、液相色譜-串聯質譜儀和高分辨質譜等儀器是實驗室常用的分析設備，具有定量準確、準確度更高等優點，特別是具有高靈敏度、高分辨率的質譜儀，是進行陽性樣品確證分析的首選。

目前，獸藥殘留測定是進行水產品質量安全監控的主要手段，氯霉素、孔雀石綠和硝基呋喃等禁用藥物是藥物殘留監控的重點，為了確保水產品的質量安全，氟甲砜霉素、甲砜霉素、磺胺類和喹諾酮類等限用藥物也早已納入監控工作。但是由于各個實驗室間的檢驗能力良莠不齊，有時會對檢驗數據的可靠性存在質疑，影響了監控工作的權威性，因此監管部門將能力驗證作為檢驗實驗室能力水平的一個主要的方式。

能力驗證（proficiency testing）是通過實驗室間比對，按照預先制定的準則來判定實驗室能力的活動。能力驗證是實驗室認可機構加入和維持國際相互承認協議（mutual recognition agreement, MRA）的必要條件之一，也是實驗室進行自我評價的手段［2］。中國農產品能力驗證考核始于2003年，雖然起步較晚，但是實驗室能力驗證的方法標準均參考國外權威機構的標準制定，10多年來技術能力取得了長足的進步。能力驗證在檢測實驗室的覆蓋率逐年增加，監管部門通過組織能力驗證，可以了解實驗室是否有能力勝任所從事的監控工作；實驗室通過參加能力驗證，了解自身能力，將其作為內部質量控制的補充措施，滿足持續改進的要求。

在實際檢測工作中，同一個檢測項目可以從多個檢測方法標準中選擇，這些技術標準主要在前處理方法和儀器設備的選擇上存在差異，需要根據檢測的目的和要求進行選擇。為了解決水產品藥物殘留檢測中由于標準方法差異和操作不熟練出現檢驗結果不準確的問題，本文綜述了水產品質量安全監控工作中關注較多的獸藥殘留測定檢測技術標準，對各種檢測方法的差異、適用性和靈敏度等進行了介紹，并詳細說明了標準操作中應該注意的問題和解決辦法等，最后提出做好能力驗證工作的建議，旨在為提高實驗室的水產品獸藥殘留檢測能力和能力驗證整體水平提供借鑒。

1 水產品獸藥殘留標準檢測方法概述

   1.1 硝基呋喃類代謝物

硝基呋喃類藥物是一類化學合成的廣譜抗菌藥物，常見的有呋喃唑酮(furazolidone，FZD)、呋喃西林(nitrofurazone，NFZ)、呋喃妥因(nitrofurantion，NFT)和呋喃它酮(furaltadone，FTD)，曾廣泛用于畜禽、水產等動物傳染病的預防與治療。硝基呋喃類藥物原藥及其代謝產物具有一定的毒性，有致畸、致突變和致癌的危險［3］。出于安全性考慮，自1993年開始，歐盟、美國等發達國家和地區先后頒布了禁止使用該類獸藥的禁令［4-5］。中國于2002年頒布的農業部第193號公告《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》，明確禁止使用硝基呋喃類廣譜抗菌藥物［6］。但是由于硝基呋喃類藥物價格低廉、療效好，在水產養殖中仍存在違禁使用的現象，在近幾年開展的水產品風險隱患排查工作中屢有檢出。硝基呋喃類藥物在生物體內代謝迅速，很難檢測到原藥，因此標準方法都是對其代謝產物進行測定，表1中列出了當前適用于水產品中硝基呋喃代謝物殘留測定的方法標準，均采用液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)進行測定，其中農業部783號公告-1-2006是中國水產品質量安全監控的推薦方法，該方法的適用范圍廣、定量準確、靈敏度高，是常用的檢測方法。

表1 水產品中硝基呋喃代謝物殘留測定方法標準

Tab.1 Detection standard of nitrofuran metabolic residues in aquatic products

   1.2 孔雀石綠

孔雀石綠（malachite green, MG）作為一種三苯甲烷類染料，曾廣泛用作水產養殖業中的驅蟲劑和殺菌劑，以防治魚類水霉病、鰓霉病、及小瓜蟲病等，是一類抗菌效力較強的藥用染料。然而，MG不僅在生物體內有明顯蓄積現象，且迅速被代謝成隱色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG)。在魚體內和環境中殘留時間長，具有潛在的“三致”作用［11］，因此包括中國在內的許多國家都禁止其在水產養殖中使用。但是由于MG抗菌效果較好，價格低廉且無有效替代藥物等原因，在近幾年的監控工作中發現MG仍在個別水產品種的養殖中違規使用。表2是水產品中MG殘留測定常用的方法標準，GB/T 19857—2005 (第一法）和GB/T 20361—2006的檢測結果相近，差異不顯著，可根據實驗室情況自行選擇。但是與液相色譜法（LC）相比，LC-MS/MS前處理操作相對簡單，定性方式更準確，是進行陽性樣品確證的必要方法，也是農業部水產品質量安全監控的首選方法。

表2 水產品中孔雀石綠殘留標準測定方法

Tab.2 Detection standard of malachile green in aquatic products

   1.3 氯霉素

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是1947年首次從委內瑞拉鏈絲菌的培養液中提取而得到的抗生素［14］，具有廣譜抗菌作用，對多數G+、G-菌均有效，在水產養殖中能有效防治爛鰓、赤皮病。CAP對人類的毒性較大，可抑制骨髓造血機能、造成過敏反應，引起不可逆的再生性障礙貧血等［15］。美國、日本、韓國和歐盟等國家和地區均已禁止在食用性動物中使用氯霉素，并規定在動物源性食品中不得檢出。中國農業部在2002年12月第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定CAP為禁用藥物，在動物性食品中不得檢出［6］。目前，CAP是中國水產品質量安全監管的對象之一，其抑菌效果優于其替代藥物，近年來在大宗水產品中的檢出率不高，但是帶入途徑復雜，仍是目前監控的重點。

水產品中CAP殘留量的測定方法很多，包括酶標法、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）和LC-MS/MS等（表3）。其中酶標法用于CAP的快速篩查測定，氣相色譜法可以用于CAP的準確定量測定， LC-MS/MS和GC-MS法均可以作為CAP殘留的確證方法，在對陽性樣品的測定中，可以互為補充。

表3 水產品中氯霉素殘留標準測定方法

Tab.3 Detection Standard of chloramphonicol in aquatic products

   1.4 磺胺類

磺胺類藥物（sulfonamides, SAs）是對氨基苯磺酰胺結構的一類藥物的總稱，主要用于預防和治療細菌感染性疾病。在水產養殖中主要用于治療魚、蝦、蟹、鱉等動物的細菌性疾病，防治鯉的赤鰭病，香魚、虹鱒等的弧菌病等。由于SAs在生物體內的作用時間和代謝時間較長，蓄積濃度超過一定值會對人體健康造成危害，導致很多細菌對SAs產生抗藥性［1］。因此，許多國家都對SAs的使用限量進行了規定，歐盟規定肉類食品中磺胺類藥物的最高殘留限量(MRL)為：單一SAs藥物≤25 μg/kg，SAs總量≤100 μg/kg；日本肯定列表規定動物源性食品中單一SAs 0.01~0.1 mg/kg，其中水產品為0.1 mg/kg；國際食品法典委員會與中國農業部235號公告中均規定動物組織中SAs藥物的MRL為100 μg/kg。

表4是水產品中磺胺類藥物殘留測定的方法標準，其中農業部958號公告-12-2007和農業部1077號公告-1-2008是常用的檢測方法，農業部958號公告-12-2007前處理繁瑣，回收率稍低，靈敏度基本能夠滿足限量要求；農業部1077號公告-1-2008方法簡便快捷，靈敏度高，可以用于磺胺類藥物的陽性確證。

2 方法操作要領和關鍵點

   2.1 硝基呋喃類代謝物

2.1.1 標液配制

1）標準儲備液配制時，應查看證書上的分子式和純度，氨基脲（semicarbazize,SEM）和1-氨基乙內酰脲（1-aminohydantoin,AHD）的分子結構中通常帶有鹽酸鹽，應根據分子量和純度進行折算，配制時可借助超聲波助溶。

表4 水產品中磺胺類殘留標準測定方法

Tab.4 Detection standard of SAs in aquatic products

2）標準儲備液低溫放置后，稀釋時應恢復至室溫，觀察是否有結晶析出，如有結晶析出，需重新搖勻溶解后再稀釋。

3）硝基呋喃類代謝物的標準曲線需要衍生化，因此要與測試樣品同時進行前處理。

2.1.2 提取過程

1）待測樣品開始提取時加入鹽酸調節pH約為1，因為不同樣品基質酸堿度有差異，故要測pH。

2）衍生化過程振蕩時間16 h并非嚴格控制，實驗證明振蕩12 h以上就能保證衍生化完全。

3）衍生化后調節pH至7.0~7.5（pH試紙測試），常規樣品不需要再調節，如果難以調節，可考慮加入50 μL NaOH溶液（1 mol/L）。

2.1.3 凈化過程

1）對于乙酸乙酯反萃取過程中發生乳化的樣品，可將離心轉速提高至6 000 r/ min以上，或者增加離心時間，可明顯改善乳化層。

2）對于定容后仍舊渾濁的樣品，可以采用正己烷去脂，14 000r/min離心10 min以上，脂肪漂浮在上層，取下層清液，過0.22 μm濾膜后進樣。

3）對于基質干擾大的樣品，如果采用SPE法凈化，可以參考GB/T 20752—2006，使用Oasis HLB 固相萃取柱。使用前依次用5 mL甲醇、10 mL水活化，將待凈化液轉移至固相萃取柱中，用10 mL水洗滌，抽至近干后，用5 mL乙酸乙酯洗脫，并于40 ℃下氮氣吹干，殘留物用1.0 mL流動相溶解。

2.1.4 色譜條件

采用C18色譜柱進行測試，推薦進樣量為10 μL。流動相中的有機相推薦使用甲醇，因為其靈敏度和分離效果更好。不同廠家的儀器對水相的選擇有差別，通常采用2 mmol/L醋酸銨或者0.1%甲酸。

2.1.5 特殊樣品的處理

1）對于殘留量超出線性范圍的樣品，可以采取以下方式：一是減少稱樣量，根據估算結果，確定是否可以通過減少稱樣量實現目的；二是加大內標的量，并在定容時稀釋到相應濃度。

2）SEM是呋喃西林藥物的特征性代謝產物，但是它作為內源性物質在甲殼類產品中普遍存在，因此在對這類樣品進行測試時，應考查該藥物的帶入途徑。

  2.2 孔雀石綠

2.2.1 標液配制

1）孔雀石綠標準品的分子結構中可能帶有草酸鹽，配制標準貯備液時應根據分子量和純度進行折算。

2）由于孔雀石綠不穩定，標準儲備液保存可采用少量分裝，-18℃避光保存的方式。

3）標準曲線現用現配，標準曲線濃度最高點≤100 ng/mL，避免檢測器飽和并防止污染儀器和色譜柱。

2.2.2 提取過程

對于標準方法GB/T 20361—2006，采用二氯甲烷進行反萃取時，如果分層不明顯，可能二氯甲烷發生倒相，此時應該加入適量的超純水或二氯甲烷，以使二氯甲烷相處于下層。

2.2.3 定容過程

采用標準方法GB/T 19857—2005測定時，定容過程應充分溶解殘留物，可超聲30 s。如果定容后樣品溶液較渾濁，可將溶液移入2 mL離心管中，進行14 000 r/min高速離心，進一步去除大分子雜質。

2.2.4 色譜條件

流動相中水相的pH對色譜峰形影響較大（圖1），pH調為4.5后峰形明顯改善，調節方式為在500 mL乙酸銨溶液中加入60 μL甲酸即可。

圖1 流動相pH對孔雀石綠（1 ng·mL-1）色譜峰形的影響

(a)未調節pH的水相;(b)pH調為4.5的水相。

Fig.1 Effects of mobile phase pH on chromatographic peak profiles of MG (1 ng·mL-1)

(a)The pH value of aqueous phase was not adjusted;(b)The pH value of aqueous phase was adjusted to 4.5.

   2.3 氯霉素

2.3.1 氣相色譜法

SC/T 3018—2004為水產品中氯霉素殘留量測定的氣相色譜法，方法前處理步驟繁瑣，操作中要注意以下幾點：

1）樣品均質提取應充分，并減少刀頭上樣品的附著，避免樣品交叉污染。

2）凈化時振蕩混合過程要劇烈、充分，每次不少于2 min，盡量減少提取液轉移過程中的損失。

3）衍生化反應前要注意防潮，所用器皿中不能有水，衍生化反應后，恢復室溫，再進行氮吹，吹干過程很短，以剛好吹干為準。

2.3.2 液相色譜-串聯質譜法

GB/T 20756—2006、SN/T 1864—2007和農業部781號公告-2-2006均為水產品中氯霉素殘留測定的LC-MS/MS法，這3個方法的測定原理相似，前處理都比較簡單，均可用于氯霉素殘留的確證分析。但是凈化過程存在區別，GB/T 20756—2006中正己烷液液萃取脫脂凈化方式的干擾較大，SN/T 1864—2007的凈化效果更好（圖2）。

圖2 3種標準方法的凈化效果比較

(a)GB/T 20756—2006；(b)SN/T 1864—2007；(c)農業部781號公告-2-2006。

Fig.2 Comparison on purification effects of the three standard methods

(a)GB/T 20756—2006; (b)SN/T 1864—2007; (c)Announcement of the Ministry of Agriculture No.781-2-2006.

對于色譜條件的選擇，當樣品中干擾雜質對氯霉素的離子化或對色譜峰背景干擾時，推薦采用梯度洗脫的方式。

   2.4 磺胺類

2.4.1 液相色譜法

農業部958號公告-12-2007為液相色譜法，包括紫外檢測法（UVD）和熒光檢測法（FLD）兩個方法。紫外法和熒光法的準確度和靈敏度都能滿足檢測要求，但是紫外法的基質干擾較大，目標峰難以有效分離，而熒光法的干擾小，靈敏度更高。采用紫外檢測法時要注意以下事項：1）濃縮過程應注意避光和嚴格控制溫度，同時也要避免因過快的濃縮降低回收率，才能確保藥物殘留在溶液中的穩定性。2）濃縮后溶解殘渣時，要保證溶劑的用量，如果不能完全溶解時可以適當增加乙酸溶液的用量，有效溶解梨形瓶中的SAs。3）SPE凈化時，如果上樣溶液中含有正己烷，會導致回收率下降，如果采用自動固相萃取儀，將上樣速度設為3 mL/min時回收率最高。

2.4.2 液相色譜-串聯質譜法

農業部1077號公告-1-2008是水產品中磺胺類多殘留測定的液相色譜-串聯質譜法，方法簡單、快速。在具體操作過程中需要注意以下兩個方面。

1）部分磺胺類標準品的溶解度不好，在進行標準溶液配制時，可以加入200~400 μL甲酸助溶，還可以降低標準貯備液的配制濃度。此外標準使用液應定期配制，否則對峰形有影響。標準曲線配制時應該采用流動相進行稀釋，用純甲醇稀釋的標準溶液在色譜柱上無保留。

2）提取過程中，應將無水硫酸鈉與樣品充分攪勻后，再加入提取液，防止樣品結塊，提高提取效率。對于復雜基質的樣品，正己烷去脂后，可以采用低溫高速離心的方法。

3 對做好水產品獸藥殘留檢測技術能力驗證工作的建議

根據能力驗證活動的要求，選擇正確的檢測方法標準，掌握檢測方法的操作要領和關鍵點，減少方法對檢測結果的影響是確保順利通過能力驗證工作的關鍵。在此基礎上，還建議采取做好準備工作，提高檢測能力，保證質量控制措施到位，以及對檢測數據進行正確的修約等如下保障措施，減少不滿意結果的產生。

   3.1 提前練習

按規定的標準操作程序或作業指導書進行操作，熟練掌握方法的前處理過程，并能重現方法的靈敏度和準確度。

  3.2 標準溶液核查

根據標準要求重新配置標準貯備液或購置有證標準溶液，并與在用標準溶液進行核對，保證標準溶液的有效性。

   3.3 考核樣品的處理

檢查編號是否準確，包裝是否完整、無破損，按照通知要求進行保存。嚴禁用微波等加熱方式對樣品解凍，應在室溫下自然解凍后再進行前處理。樣品前處理過程中，應盡量避光操作。

   3.4 做好質量控制

質量控制中應包括空白實驗(包括試劑空白和對應的基質空白)和控制樣品（檢出限加標、3~10倍檢出限加標），與考核樣品同時測定。空白實驗可確保空白值在控制限內，避免測試過程中的污染和空白基質中的干擾。控制樣品的有效性可確保測試結果的靈敏度和準確度。

   3.5 檢測結果的判斷

在進行檢測結果計算時，首先應考察校準曲線是否滿足要求，其次是平行樣的測定結果是否在相對偏差范圍內，然后是質控樣品的準確度和靈敏度是否符合標準要求，還要進行不確定度的計算。對于偏差較大的數據，可以采用統計學方法進行測算，如平均值的置信區間等。

4 小結

通過對水產品獸藥殘留測定中常用的檢測標準進行梳理，強化檢測方法中的操作要領和關鍵點，使檢測人員的實驗操作技能得到提升，有利于提高水產品獸藥殘留檢測水平和能力驗證的通過率，保證檢測質量。隨著水產品能力驗證工作的規范性和公正性的不斷加強，實驗室的檢測能力將會得到快速提高，水產品質量安全監管水平也會不斷提升，有利于保障中國的水產品質量安全。