柑橘原產(chǎn)于中國，包括柑、橘（桔）、橙、柚、枳等品種，目前以種植、加工、銷售等為核心的柑橘產(chǎn)業(yè)已成為我國南方地區(qū)推動農(nóng)業(yè)高效發(fā)展、助力農(nóng)民增收致富的支柱產(chǎn)業(yè)，極大滿足了消費(fèi)者對柑橘鮮果及加工產(chǎn)品的需求。在柑橘種植過程中廣泛使用的防治蟲害農(nóng)藥可能殘留在柑橘果汁加工品中，長期飲用農(nóng)藥殘留超標(biāo)的果汁飲料，雖然不會引發(fā)急性中毒，但可能導(dǎo)致慢性中毒、神經(jīng)系統(tǒng)損傷，甚至影響生殖系統(tǒng)。隨著有機(jī)磷、有機(jī)氯等強(qiáng)毒性農(nóng)藥的禁用，越來越多的柑橘種植戶開始使用毒性較低、無特殊氣味的氨基甲酸酯類農(nóng)藥。這類農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、高效、廣譜、對人畜毒性低且易分解等特點，但其致癌性不容忽視。
目前，果汁中農(nóng)藥殘留的檢測方法有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法等。在農(nóng)藥殘留分析中，亟待解決的關(guān)鍵問題是消除共提取基質(zhì)干擾物對檢測靈敏度、準(zhǔn)確度及儀器的影響。常用的農(nóng)藥殘留前處理方法有QuEChERS、固相萃取（SPE）等，其中QuEChERS應(yīng)用廣泛，但其去除基質(zhì)干擾物的效果有限；SPE存在試劑消耗量大、污染環(huán)境、成本高且耗時長等弊端。基于此，本工作采用改良的針筒式固相萃取管凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定柑橘類果汁中12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥（涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、速滅威、殘殺威、克百威、甲萘威、異丙威、混殺威、仲丁威）的殘留量。該方法無需活化萃取柱即可同步完成萃取液的凈化與過濾，能夠有效去除基質(zhì)干擾物，在確保檢測靈敏度和準(zhǔn)確度的同時，簡化了操作過程。
Part.01 試驗方法
稱取柑橘類果汁樣品置于離心管中，加入乙腈，搖勻，渦旋提取，加入萃取鹽包，振蕩冷卻，然后離心，用針筒式固相萃取管（連接有機(jī)相濾膜）抽取上清液，再用移液器移取濾液至樣品瓶中，按照儀器工作條件進(jìn)行測定。樣品前處理流程如圖1所示，同時進(jìn)行空白試驗。
Part.02 結(jié)果與討論
2.1 質(zhì)譜條件的選擇
氨基甲酸酯類農(nóng)藥多數(shù)為極性物質(zhì)，在水中具有較高的溶解度，且在酸性條件下較為穩(wěn)定。試驗以100.0μg·L−1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對象，在未接入色譜柱的條件下，以體積比1∶1的甲醇-含0.1%甲酸的5mmol·L−1乙酸銨溶液的混合溶液作為流動相，促進(jìn)目標(biāo)化合物的離子化，提高靈敏度。采用質(zhì)譜Optimizer功能進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，通過一級和二級質(zhì)譜掃描分析，選取高響應(yīng)強(qiáng)度的母離子碎片和子離子碎片，并分別優(yōu)化各離子對的碎裂電壓和碰撞能量。結(jié)果顯示，由于異丙威和混殺威的分子式相同、極性相似，產(chǎn)生了相同的離子對m/z 194/137，且響應(yīng)強(qiáng)度相近，可能會干擾定量，因此最終選取離子對m/z 194/95，194/77識別異丙威，其他氨基甲酸酯類農(nóng)藥經(jīng)優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。
2.2 色譜柱的選擇
試驗考察了Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（50mm×2.1mm，1.8μm）和 Agilent Proshell 120 EC-C18色譜柱（100mm×2.1mm，2.7μm）對100.0μg·L−1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離效果的影響。結(jié)果表明，Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱在硅膠制造和鍵合技術(shù)方面較普通反相柱（Agilent Proshell 120 EC-C18色譜柱）有更好的性能（峰形、柱效、分離度），對酸性和中性化合物都有良好的分離效果。因此，試驗選擇Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱進(jìn)行分離。
在優(yōu)化的儀器工作條件下，100μg·L−1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見圖2。
2.3 樣品前處理的選擇
2.3.1 提取溶劑
常采用乙腈或者酸化的乙腈溶液作為提取溶劑對農(nóng)藥殘留進(jìn)行提取，其可以沉淀大分子蛋白并減少弱極性化合物的干擾。試驗以空白橙汁加標(biāo)樣品為研究對象，考察了4種提取溶劑 [ 乙腈、含0.05%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的乙腈溶液、含0.1%甲酸的乙腈溶液和含0.2%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的乙腈溶液 ] 對12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥提取效果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)采用乙腈作為提取溶劑時，12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率為86.7%~106%，當(dāng)采用其余 3 種提取溶劑時，12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率為75.8%~113%。因此，試驗選擇的提取溶劑為乙腈。
2.3.2 萃取鹽包
硫酸鎂和氯化鈉等鹽類通過鹽析作用促進(jìn)有機(jī)相與水相有效分離，減少后續(xù)提取液氮吹濃縮不完全的問題。硫酸鎂在溶解過程中會短時間內(nèi)釋放大量熱量，若用量過高，過大的熱量會導(dǎo)致提取溶劑的揮發(fā)，甚至引起氨基甲酸酯類農(nóng)藥的降解；氯化鈉雖然能加快有機(jī)相與水相的分離，但也需控制用量，避免影響目標(biāo)化合物的回收效果。試驗以空白橙汁加標(biāo)樣品（加標(biāo)量為5.0μg·kg−1）為研究對象，考察了3種萃取鹽包[（Ⅰ）2g氯化鈉、（Ⅱ）6g無水硫酸鎂 +1.5g氯化鈉、（Ⅲ）4g無水硫酸鎂 +1g氯化鈉 +0.5g檸檬酸氫二鈉 +1g檸檬酸鈉 ] 對12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥回收率的影響，結(jié)果見圖3。
由圖3可知：當(dāng)采用萃取鹽包Ⅰ時，除了涕滅威亞砜的回收率為85.0%，其他11種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率均超過 100%，容易出現(xiàn)測定結(jié)果偏高的誤判；當(dāng)采用萃取鹽包Ⅱ時，12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率為84.4%~94.4%；當(dāng)采用萃取鹽包Ⅲ時，涕滅威和三羥基克百威的回收率均較低，約為82.5%，80.0%。因此，試驗選擇含6g無水硫酸鎂+1.5g氯化鈉的萃取鹽包進(jìn)行萃取。
2.3.3 針筒式固相萃取管
柑橘類果汁富含糖類與色素等物質(zhì)，若樣品凈化不徹底，不僅會降低殘留農(nóng)藥的回收率，還可能導(dǎo)致液相系統(tǒng)壓力升高、污染質(zhì)譜儀。在樣品前處理過程中，常用的凈化材料有PSA、GCB、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）和無水硫酸鎂等，其中PSA通過弱陰離子交換作用形成氫鍵，能有效去除脂肪酸、糖類等物質(zhì)；C18能去除脂類等非極性物質(zhì)；GCB能去除色素、類固醇等物質(zhì)。試驗以空白橙汁加標(biāo)樣品（加標(biāo)量為5.0μg·kg−1）為研究對象，考察了2種規(guī)格的針筒式固相萃取管（規(guī)格一：2mL，含25mgPSA+2.5mgGCB+150mg無水硫酸鎂；規(guī)格二：5mL，含50mg PSA+5.0mgGCB+200mg無水硫酸鎂）對12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)采用2mL針筒式固相萃取管凈化時，12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率均大于90.0%，除涕滅威和三羥基克百威外，其余10種農(nóng)藥的回收率為95.0%~100%，凈化效果良好，符合 GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中回收率的要求；當(dāng)采用5mL針筒式固相萃取管凈化時，12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率均較低，為82.5%~98.3%。因此，試驗選擇2mL針筒式固相萃取管進(jìn)行凈化。
2.4 基質(zhì)效應(yīng)
試驗分別選用了6種空白樣品基質(zhì)（甌柑汁、橙汁、西柚汁、青檸汁、金桔汁和檸檬汁）溶液配制基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，同時以乙腈配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，獲得工作曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過工作曲線斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值計算基質(zhì)效應(yīng)（ME）。 當(dāng) ME 值<0.8時為強(qiáng)基質(zhì)抑制效應(yīng)，當(dāng)0.8≤ME值≤1.2時為弱基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng) ME值>1.2時為強(qiáng)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，結(jié)果見圖4。
由圖4可知，6種基質(zhì)中12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的ME值為0.751~1.256，其中檸檬汁基質(zhì)對克百威和甲萘威的基質(zhì)效應(yīng)影響較大，甌柑汁基質(zhì)對部分農(nóng)藥呈現(xiàn)強(qiáng)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，橙汁基質(zhì)對12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥均呈現(xiàn)弱基質(zhì)效應(yīng)，其余3種基質(zhì)對除甲萘威之外的 11種農(nóng)藥基本呈現(xiàn)弱基質(zhì)效應(yīng)。為消除基質(zhì)效應(yīng)、提高測定結(jié)果準(zhǔn)確度，試驗選擇采用基質(zhì)匹配法進(jìn)行定量。
2.5 方法學(xué)考察
2.5.1 工作曲線和測定下限
由于甌柑汁存在基質(zhì)效應(yīng)，試驗以甌柑汁作為代表性基質(zhì)，按照儀器工作條件測定了空白甌柑汁基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以各氨基甲酸酯類農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的定量離子的響應(yīng)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示，12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥工作曲線的線性范圍均為0.5~10.0μg·L− 1，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。
按照試驗方法測定空白甌柑汁加標(biāo)樣品（加標(biāo)量為5.0μg·kg−1），以10倍信噪比計算測定下限（10S/N），結(jié)果均為1.0μg·kg−1。
2.5.2 精密度和回收試驗
按照試驗方法對空白甌柑汁樣品進(jìn)行1.0，5.0，20.0μg·kg−1等3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗，每個濃度水平平行制備6份，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3。
由表3可知，12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率為86.8%~104%，測定值的RSD為1.2%~7.5%，說明本方法的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足柑橘類果汁中12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測要求。
2.6 樣品分析
按照試驗方法分析30份柑橘類果汁樣品，包括5份橙汁、5份蜜柑果汁、5份西柚汁、5份甌柑汁、5份鮮榨蜜柑汁和5份鮮榨橘汁，其中蜜柑果汁、鮮榨蜜柑汁和鮮榨橘汁等3種基質(zhì)種類性質(zhì)與甌柑汁和橙汁基質(zhì)種類性質(zhì)接近，故不另外進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)討論。結(jié)果顯示，在1份鮮榨蜜柑汁和1份鮮榨橘汁中檢出克百威，檢出量分別為 1.6，4.2μg·kg−1，均小于GB 2763— 2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定的限量值（0.02mg·kg−1）。
Part.03試驗結(jié)論
本工作提出了一種農(nóng)藥殘留快速篩查分析方法，采用針筒式固相萃取管凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定柑橘類果汁中12種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量。改良的針筒式固相萃取管不僅簡化了前處理操作，并大幅提升了檢測效率，在靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度方面均能夠滿足農(nóng)藥殘留的檢測要求。該前處理方法具有良好的通用性和實用性，可為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供高效可靠的技術(shù)支持，有望在食品檢測領(lǐng)域推廣應(yīng)用。
