摘要

中樞神經系統疾病是全球性的公共衛生問題, 隨人口老齡化而加劇。核酸藥物在該領域潛力巨大, 通過堿基互補配對原理靶向特定基因序列, 于蛋白質表達前進行干預, 具有靶向性高、安全性好且研發周期短的優勢。然而, 血腦屏障的存在和中樞神經系統的病理復雜性限制了核酸藥物的遞送, 其療效依賴于有效的遞送系統。本文系統介紹了近年來用于治療中樞神經系統疾病的核酸藥物及其作用機制, 深入分析腦部遞送障礙, 重點闡述了血腦屏障的生理結構、功能及可實現遞送的途徑及其相關機制。詳述了利用病毒載體、核酸藥物改造技術、脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒和外泌體等突破血腦屏障的機制及其在核酸藥物遞送中的應用。本綜述旨在匯總和分析當前核酸藥物跨越血腦屏障、提高靶向性和穩定性的策略, 探討提高遞送效率的方法, 并為未來的研究和臨床應用提供指導, 以期推動核酸藥物在治療中樞神經系統疾病方面的發展。

 

關鍵詞

中樞神經系統疾病; 血腦屏障; 核酸藥物; 基因治療; 藥物遞送系統

 

中樞神經系統(central nervous system, CNS)包括大腦和脊髓, 是人體神經系統的核心部分。中樞神經系統疾病是全球健康的重大挑戰, 包括阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森病(Parkinson's disease, PD)及亨廷頓病(Huntington's disease, HD)等神經退行性疾病, 自閉癥譜系障礙、Rett綜合征等神經發育障礙, 以及腦卒中、腦腫瘤和多發性硬化癥等。這些疾病影響著全球數億人口, 已成為全球第二大死亡原因, 其死亡率和致殘率負擔隨人口老齡化加劇而持續上升。

傳統藥物治療中樞神經系統疾病面臨諸多挑戰, 其中血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)是關鍵限制因素。BBB由腦毛細血管內皮細胞與神經血管單元中的周細胞、星形膠質細胞、神經元和小膠質細胞相互作用形成, 是一種選擇性通透屏障。它在保護中樞神經系統免受毒素、病原體、炎癥、損傷和疾病侵害等方面發揮著重要作用, 但同時也限制了大多數候選藥物通過外周給藥進入。因此, 目前神經系統疾病的治療藥物有限, 可用的治療方案少, 新藥的批準率低。

在神經系統疾病的治療中, 部分傳統小分子藥物因其較小的分子質量和較高的脂溶性, 能夠有效穿透BBB, 通過調節神經遞質、調控離子通道及提供神經保護等機制發揮作用。例如, 左旋多巴用于改善帕金森病癥狀、苯妥英鈉用于癲癇發作, 以及多奈哌齊用于阿爾茨海默病緩減癥狀等。但這類藥物通常存在特異性弱、難以精準調控基因層面的病理機制等局限性。蛋白藥物(如單克隆抗體和神經生長因子等)具有較好的特異性, 通常通過特異性結合病理分子、調節信號通路并清除有害蛋白等方式實現治療效果, 如單克隆抗體可通過清除特定的致病蛋白(如阿爾茨海默病中的β-淀粉樣蛋白)來減緩疾病進展。但蛋白類藥物在臨床應用中也面臨著BBB穿透困難、生產成本高及潛在的免疫反應等挑戰。

相比之下, 核酸藥物在治療中樞神經系統疾病中展現出顯著優勢。傳統藥物主要針對蛋白靶點, 僅覆蓋已知致病靶點的15%, 而核酸藥物通過干預基因轉錄和信使RNA(messenger RNA, mRNA)環節, 理論上可靶向任何可轉錄基因序列, 極大擴展了潛在的治療靶標。基于堿基配對的序列特異性設計, 核酸藥物能夠精準識別目標基因, 顯著降低脫靶效應, 提高治療安全性。此外, 核酸藥物具有較高的生產效率, 一旦解決其遞送和化學性質等關鍵問題, 僅需改變靶基因序列即可快速開發新藥, 大幅縮短研發周期。然而, 核酸藥物需在胞內發揮作用, 其固有的高負電荷密度及體內核酸酶引起的不穩定性要求核酸藥物的體內遞送需依賴載體介導。因此, 載體的開發需要基于對體內生理屏障的深入研究, 包括循環中的降解清除與蛋白吸附、血腦屏障、細胞攝取障礙、內吞體/溶酶體屏障, 以及藥物控制釋放機制等。目前, 聚合物納米顆粒、脂質納米顆粒、無機納米顆粒和外泌體等工程載體已被廣泛開發用于將核酸藥物輸送到大腦。通過調整載體的物理和化學特性, 引入官能團進行表面修飾, 可增強載體的穩定性、提高其對免疫監控的逃逸能力、優化器官靶向性和細胞定向性, 以及提升對微環境的敏感性等。

本文介紹了目前有潛力用于治療中樞神經系統疾病的核酸藥物及其作用機制; 概述了BBB作為核酸藥物遞送的主要障礙, 穿越BBB的主要方法及相關機制機理; 重點討論了各種遞送系統(如病毒載體、核酸藥物偶聯、脂質納米顆粒、聚合物納米顆粒和外泌體等)的特性及它們在介導核酸藥物腦部遞送方面的相關進展。

 

1核酸藥物的分類及其作用機制

核酸藥物的作用機制根據其生物學效應可分為3個主要類別: 下調基因表達、上調基因表達和基因編輯。小干擾核糖核酸(small interfering RNA, siRNA)、小分子核糖核酸/微核糖核酸(microRNA, miRNA)和反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASOs)是通過與靶RNA配對來抑制靶基因的典型核酸藥物。mRNA和質粒脫氧核糖核酸(plasmid DNA, pDNA)通常用于增加靶基因的表達。而成簇的規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein, CRISPR/Cas)系統可以增加、抑制或糾正靶基因的表達。

1.1 siRNA

siRNA也叫作沉默RNA, 通常以雙鏈形式存在, 單鏈形式發揮作用, 由21到25個核苷酸組成, 3′端一般有兩個游離的堿基。它可以由長的雙鏈RNA或小發夾RNA(small hairpin RNA, shRNA)經Dicer酶(一種特殊核糖核酸酶, 屬于RNase III家族)特異性識別并切割形成(內源性), 也可以由化學合成的方法轉染到細胞中(外源性)。siRNA可以通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)機制, 特異性地促進靶細胞質中靶mRNA降解或抑制其翻譯表達, 產生基因沉默效應。

在細胞質中, siRNA與RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC)結合后, 解旋成單鏈。正義鏈被降解, 而與目標轉錄本(完全)互補的反義鏈作為導向子(guide strand)留在RISC上, 形成活性的RISC-siRNA復合物。一旦RISC-siRNA復合物與目標mRNA相互匹配, RISC上具有核酸內切酶活性的Argonaute蛋白將引導該mRNA的降解或阻止其翻譯成蛋白質(圖1A)。通過這一機制, siRNA能夠精準沉默目標基因的表達, 在細胞內發揮調控作用。這種基因沉默效果是可逆的, 只要停止給予siRNA藥物, 靶基因就會恢復表達。siRNA可以針對任何編碼蛋白質或非編碼RNA的基因, 具有高效率和高度特異性, 目前已有多種siRNA藥物獲批上市。其中, ONPATTRO是FDA批準的首款siRNA藥物, 用于治療遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性伴多發性神經病, 是RNAi領域的一個里程碑事件。

1.2 miRNA

miRNA是一類內源性非編碼單鏈RNA分子, 長度約為19~24個核苷酸。miRNA在細胞內通過參與RNAi機制來調控基因表達, 從而影響細胞的生理過程。miRNA的作用機制與siRNA類似, 但也有一些獨有的特征。miRNA可通過與靶mRNA的3′非編碼區(untranslatd region, UTR)或編碼區互補結合, 導致靶mRNA的降解或翻譯抑制, 從而影響細胞的生長、分化、凋亡、代謝等多種生理過程。內源性的pre-miRNA在進入到細胞質中后由Dicer切割成約22個核苷酸的不完全配對的雙鏈RNA, 一條鏈(passenger strand)降解, 另一條鏈作為guide strand與Argonaute蛋白結合形成RISC。RISC通過miRNA的5′端與靶基因mRNA的3′UTR部分互補結合, 抑制目標mRNA的翻譯或促進其降解(圖1A)。這一過程導致目標基因的表達下調, 實現了miRNA在基因調控中的功能。siRNA與miRNA都是通過RNAi的方式來發揮作用, 但是也存在一些不同。miRNA來源于較短的莖環RNA產物, 主要作用于靶標基因的3′UTR區, 可以通過不完全配對抑制翻譯或者降解mRNA來沉默基因, 在翻譯水平和轉錄后水平發揮作用, 具有更廣泛的調控范圍。而siRNA具有100%的互補性, 通常進行轉錄后水平的調控, 即通過在翻譯前切割mRNA導致靶標基因的降解, 具有更高的特異性。

1.3 ASOs

ASOs是人工合成的單鏈核酸聚合物, 通常由18~30個核苷酸組成。它們與目標基因的特定RNA序列互補結合, 通過干擾mRNA功能實現治療效果(圖1B)。ASOs主要通過3種機制調控基因表達: 降解mRNA(招募RNase H切割降解mRNA, 阻斷蛋白質合成); 抑制翻譯(ASOs與mRNA結合, 阻止mRNA與核糖體結合, 降低蛋白質合成); 調控剪接(ASOs結合于pre-mRNA的外顯子區域, 使外顯子被剪切掉, 糾正基因剪接異常)。ASOs因其高度特異性在治療基因相關疾病, 如脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy, SMA)和遺傳性視網膜病變等方表現出色。

Figure 1 Classification and mechanisms of action of nucleic acid drugs, including siRNA and miRNA (A), ASOs (B), mRNA and pDNA (C), CRISPR/Cas (D), aptamer (E). ASOs: Antisense oligonucleotides. Created in https://www.BioRender.com

1.4 mRNA

mRNA是一種單鏈長核糖核酸, 傳遞DNA中的遺傳信息并翻譯合成蛋白質(圖1C)。其結構包括5′端帽子結構, 保護mRNA免受降解并促進轉運和翻譯; 5′端UTR, 調節mRNA穩定性和翻譯效率; 編碼序列, 翻譯成蛋白質; 3′端UTR, 影響mRNA穩定性和降解; 以及多聚腺苷酸尾巴, 保護mRNA并增加其轉運和翻譯效率。

mRNA在核酸藥物療法、診斷生物標志物和治療靶標等方面應用廣泛。細胞內的mRNA可以翻譯產生治療性蛋白, 替代有缺陷或缺失的蛋白。進入體內的mRNA由細胞表達特定蛋白, 避免體外因素影響, 并調節免疫系統, 消除包括癌細胞在內的威脅。編碼抗原序列的mRNA疫苗通過脂質納米載體遞送進入細胞, 由人體細胞翻譯產生抗原, 激活免疫反應。mRNA療法主要應用于傳染病疫苗、治療性癌癥疫苗、免疫腫瘤學疫苗和蛋白質替代等。

1.5 pDNA

pDNA是一種環狀雙鏈DNA分子, 可以獨立于染色體或核區復制, 主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中。它通常包含一個或多個外源基因及其調控元件, 如啟動子、終止子和選擇性標記基因。通過轉染等方法, pDNA可將外源基因導入目標細胞, 隨后被轉錄成mRNA并翻譯成蛋白質, 用于糾正或補充缺失或異常基因(圖1C)。作為基因載體, pDNA具有自主復制和轉錄的能力, 在子代細胞中保持恒定拷貝數, 表達所攜帶的遺傳信息。pDNA因其安全、低毒、低免疫原性和易于分離提取等優點, 廣泛應用于基因治療、細胞治療和核酸疫苗等領域。

基于pDNA的基因治療是將治療基因整合到質粒載體中, 通過各種遞送方式(如電穿孔、脂質體、病毒載體等)將質粒導入靶細胞, 從而實現基因表達以治療疾病的一種基因治療策略。DNA疫苗是將編碼特定抗原的基因序列插入質粒載體中, 通過注射使機體細胞表達目標抗原, 從而誘導機體產生免疫應答的一種新型疫苗技術。相較于mRNA, pDNA更具成本效益、可運輸性和穩定性。然而, 其缺點也十分明顯, 主要是轉染效率低且表達起效慢, 因為pDNA需要跨越核膜進入細胞核才能發揮作用, 且需要經過轉錄和翻譯兩個步驟才能產生蛋白質。此外, pDNA還存在潛在的基因組整合風險和免疫原性問題, 其較大的分子質量也增加了細胞遞送的難度。

1.6 CRISPR/Cas

CRISPR/Cas是一種存在于原核生物(細菌和古細菌)的免疫系統, 能夠在遭到病毒后提取出病毒的一小段DNA存儲到自身基因組的特定區域上(CRISPR存儲空間)。當再次遇到病毒入侵時, 原核生物根據存儲的DNA識別并切割病毒DNA。CRISPR/Cas系統包含CRISPR基因座和Cas基因兩部分。CRISPR基因序列包括前導序列(leader)、重復序列(repeat)和間隔序列(spacer)(圖1D)。前導序列位于CRISPR基因上游, 引導重復和間隔序列的轉錄; 重復序列含20~50個堿基對, 形成穩定RNA的發卡結構; 間隔序列存儲細菌從外源DNA捕獲的片段, 提供免疫記憶。Cas基因編碼與CRISPR序列共同作用的蛋白, 包括Cas1到Cas10, CRISPR/Cas系統分為兩類: 多蛋白復合物的第一類(I、III、IV型)和依賴單一Cas蛋白的第二類(如II型Cas9和V型Cpf1)。最常用的是CRISPR/Cas9系統, 由sgRNA和Cas9蛋白組成, sgRNA識別PAM序列, 激活Cas9切割DNA, 導致雙鏈斷裂, 通過NHEJ或HDR修復。Cas9蛋白和sgRNA可以共編碼到同一pDNA中、作為mRNA或核糖核蛋白復合物(ribonucleoprotein complex, RNP)使用。例如, Park等利用RNP結合兩親性R7L10肽, 靶向神經元中的BACE1基因, 降低β淀粉樣斑塊(β-amyloid plaques, Aβ) 42分泌, 用于治療AD。盡管CRISPR/Cas9技術在疾病模型開發和遺傳病治療方面具有良好的應用前景，但可能導致正常基因功能的破壞或導致基因組不穩定的脫靶效應仍然是一個嚴重的問題。

1.7 適配體

適配體是完全人工設計和合成的單鏈DNA或RNA寡核苷酸, 具有特定的三維結構, 通過氫鍵、靜電相互作用和范德華力與目標分子相互作用。大多數適配體通過指數富集配體系統篩選得到。與其他以核酸為基礎的療法不同, 適配體不僅通過互補堿基配對識別特定靶標序列, 還可以形成三維二級結構與蛋白質相互作用來實現靶向。通過阻斷關鍵分子、誘導降解、遞送藥物、調節信號傳導等多種方式, 它們能夠有效調控生物過程, 干預疾病進程(圖1E)。適配體藥物在抗癌、抗病毒、抗炎和免疫調節等領域展示了廣泛的應用潛力, 且具有高特異性、低免疫原性和易于修飾等優勢。Cheng等開發了靶向適配體并探索其殺死膠質瘤細胞的機制。研究表明, AS1411與膠質瘤細胞中過表達的核仁素結合, 誘導p53上調和Bcl-2下調, 隨后引發細胞凋亡和周期停滯, 展示了其在膠質瘤治療中的潛力。由于其特殊結構, 適配體還可以用作靶向配體。例如, AS1411與透明質酸雙功能化的微乳劑可穿透BBB, 靶向膠質瘤并遞送shikonin和docetaxel。這種制劑能夠選擇性地在U87膠質瘤細胞中積累, 抑制腫瘤生長和癌癥干細胞的形成。然而, 體內穩定性和遞送效率仍是其進一步發展的挑戰。

與傳統的小分子和蛋白質藥物相比, 核酸藥物在治療靶點范圍和靶點特異性方面表現出更顯著的優勢, 且其治療效果通常更為持久。截至目前, 在核酸藥物開發領域, 已有9款ASOs、6款siRNA、2款mRNA疫苗和2款RNA適配體藥物獲得批準上市。其中nusinersen可以糾正SMN基因的剪接缺陷, 增加SMN蛋白的產生, 進而改善SMA患者的神經系統功能和運動能力, 而tofersen則用于治療由SOD1基因突變引起的肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)。如表1所示, 還有多款針對中樞神經系統疾病的核酸藥物正在臨床試驗階段, 進一步證明了核酸藥物在這個治療領域中的巨大潛力。

 

2核酸藥物腦部遞送遇到的障礙

基于RNA或DNA的基因治療及基于CRISPR的治療性基因組編輯雖然為中樞神經系統疾病的治療提供了潛在的希望, 但核酸類藥物遞送至中樞神經系統的過程中面臨著多重生理屏障的挑戰。這些障礙包括循環系統中的降解和清除、BBB、細胞攝取效率、內體/溶酶體屏障及藥物釋放等問題, 這些因素共同制約了核酸藥物向大腦的有效遞送(圖2A~E)。

Figure 2 Challenges, methods, and mechanisms of nucleic acid drug delivery across the BBB. A−E: Barriers encountered in the brain delivery process of nucleic acid drugs; F: Different administration methods; G: Different mechanisms of crossing the BBB.

2.1 循環中的降解與清除

經靜脈給藥后, 核酸藥物隨血液循環分布至全身(圖2A), 在此過程中, 核酸藥物在體內的清除途徑和生物分布表現出明顯的尺寸依賴性。具體而言, 小于6nm的核酸藥物制劑主要通過腎小球濾過單元被迅速清除; 而中等尺寸的制劑(20~150nm)則傾向于在肝臟中被單核巨噬細胞(mononuclear phagocyte, MPS)捕獲并清除。MPS由一系列細胞組成, 包括肝竇內皮細胞及庫普弗細胞, 其中庫普弗細胞作為常駐的巨噬細胞, 具有強大的吞噬能力, 它們與內皮細胞共同作用，能夠捕獲并清除肝臟中超過90%的核酸藥物。而超過200nm的核酸制劑對MPS的清除具有較高的抵抗力, 并會在肝臟、脾臟和肺部積累。

血液循環中的核酸藥物制劑與血漿蛋白之間的非特異性結合對其體內分布和治療效果構成了重大挑戰。核酸因其固有的負電荷, 易于與血漿蛋白(例如白蛋白和球蛋白)非特異性結合。這種非特異性結合可能會降低藥物的有效濃度, 并加速藥物在體內的清除過程。此外, 將核酸藥物封裝在納米載體中進行遞送時, 這些載體在血液循環中也會吸附血漿蛋白形成蛋白冠。蛋白冠的形成會改變納米載體的表面特性, 包括化學組成、電荷和親疏水性, 進而影響其在體內的分布、細胞攝取及免疫反應。而這尤其影響核酸藥物腦部遞送常采用“主動靶向”策略的納米載體。這類載體表面常設計有小分子、肽段和抗體片段等配體以提高其腦靶向能力, 而其表面特性的改變可能會通過電荷特異性或分子間的相互作用進一步促進蛋白冠的形成, 由于冠層掩蓋了靶向配體, 納米載體的組織歸巢效率會大幅下降。例如, Salvati等發現, 轉鐵蛋白修飾的聚乙二醇化二氧化硅納米粒子經胎牛血清處理后在表達轉鐵蛋白受體的腫瘤細胞中的攝取減少, 靶向性降低。但在無血清培養基或磷酸鹽緩沖液中, 它們能高效地通過轉鐵蛋白受體介導的內吞作用被細胞攝取。

由此可見, 核酸藥物制劑在體內應盡量避免核酸酶降解、肝臟和腎臟快速清除及與血漿蛋白的非特異性結合, 才能維持其穩定性和療效。此外, 進一步優化納米載體的設計, 以減少蛋白冠的形成并保持其靶向配體的活性, 對于提高核酸藥物在腦部的遞送效率至關重要。

2.2 血腦屏障

BBB是一種具有高度選擇性的半透膜結構, 通過將血液與大腦細胞外液隔離來維持腦內環境穩定, 對大腦起著至關重要的保護作用。其結構主要由腦血管內皮細胞(endothelial cells, ECs)、基底膜(basement membrane)、周細胞(pericyte)和星形膠質細胞(astrocyte)的終足(end foot)組成(圖2G)。作為BBB的核心結構, ECs構成腦血管內層, 通過細胞間緊密連接限制水溶性及大分子物質通過, 并表達特殊轉運蛋白和外排轉運蛋白來調控物質轉運。周細胞環繞毛細血管內皮細胞, 嵌入基底膜, 參與調控腦血流量與BBB通透性。星形膠質細胞的末梢環繞腦血管, 經終足連基底膜, 其確切作用雖存爭議, 但目前公認它能與內皮細胞、周細胞共同維持BBB功能。基底膜位于上述細胞之間, 為鄰近的細胞提供結構與功能支持, 還能通過與細胞表面受體作用調節細胞行為與信號傳導。上述組成部分協同構成高選擇性屏障, 既保障必需物質進入, 又阻擋了有害物質, 但也給核酸藥物入腦帶來挑戰。BBB阻礙了98%小分子(<500Da)及幾乎所有大分子(>1kDa)神經治療藥物的穿透, 極大地增加了中樞神經系統疾病的治療難度, 因此開發能夠有效突破BBB的遞送策略成為當前研究的重要方向。

2.3 進入靶細胞

當核酸藥物達到目標細胞的表面, 首先需要進入細胞(圖2C)。核酸藥物進入靶細胞的主要途徑有吞噬作用、巨胞飲作用、網格蛋白介導的內吞作用、小窩依賴性內吞作用、網格蛋白/小窩非依賴性內吞作用等。由于其分子質量大且帶負電, 核酸藥物難以直接穿過細胞膜進入細胞, 為了提高細胞攝取效率和逃避內體/溶酶體的降解, 研究人員開發了多種遞送方法。一方面通過化學修飾, 如2' O-甲基化、硫代磷酸酯修飾等, 可以提高核酸藥物的穩定性和細胞膜滲透性; 另一方面, 利用納米載體可以實現核酸藥物的精確靶向和目標細胞對其的高效攝取。通過將核酸藥物包裹在納米載體顆粒中, 以提高其穩定性和細胞攝取能力, 同時通過表面修飾配體(主要是小分子與肽)與細胞膜上的特異性受體結合精準靶向病變細胞, 用更少的劑量獲得有效的治療效果并減少不良反應。例如, 葉酸是一種典型的小分子配體, 它能夠與腫瘤細胞膜上高度表達的葉酸受體特異性結合, 常用于治療腦腫瘤。甘露糖修飾的載體可以與小膠質細胞上的甘露糖受體結合, Tet1肽(HLNILSTLWKYR)對神經元上的三唾液酸神經節苷脂具有高親和力, 這使得它們成為治療神經退行性疾病的有力工具。

2.4 內體/溶酶體屏障

核酸藥物及其納米載體經細胞攝取后通常會經過內體/溶酶體途徑(圖2D), 由于溶酶體內的酸性環境(pH4~5)和降解酶, 核酸藥物易發生降解, 轉染效率降低。目前主要有3種方法克服內體/溶酶體屏障, 包括被動地破裂內體/溶酶體、主動誘導內體/溶酶體結構變化, 以及在內吞作用過程中繞過內體/溶酶體途徑。

利用質子海綿效應來促使內質網/溶酶體破裂是核酸藥物遞送中的一種常見的逃逸策略。含有伯胺、仲胺和叔胺等堿性基團的聚合物能夠吸附氫質子, 從而顯著增加內質網/溶酶體內的滲透壓, 導致內質網/溶酶體吸水膨脹并破裂, 釋放出藥物制劑。富含伯胺、仲胺和叔胺基團的聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)是最典型的具有質子海綿效應的聚合物, 被廣泛用于遞送核酸藥物, 然而, 使用PEI時也需注意其潛在的毒性問題。除了PEI, 其他多種陽離子聚合物也被用于促進核酸藥物的傳遞并幫助其從內體/溶酶體中逃逸, 例如聚賴氨酸(含伯胺)、聚(L-組氨酸)(含咪唑基團)、聚精氨酸(含伯胺和仲胺)及聚(β-氨基酯)(含叔胺)。狂犬病病毒糖蛋白肽(rabies virus glycoprotein peptide, RVG) 29-9R肽是一種通過在RVG29分子的羧基末端添加含有9個精氨酸殘基構建而成的, 它能夠攜帶核酸藥物, 并通過質子海綿效應促進內體/溶酶體的逃逸, 同時保持RVG29的原有功能不受影響。這些研究進展為核酸藥物的遞送提供了新的思路和方法。

目前也有多種載體的逃逸機制是通過與內體/溶酶體的相互作用誘導其結構破壞。Shi等通過將疏水性光敏劑TBD與聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾, 合成了一種兩親性聚合物TBD-PEG-N3。該聚合物能夠自組裝為聚合物納米顆粒, 并通過點擊化學與二苯并環辛炔修飾的ASO結合。在光照條件下, 光敏劑TBD產生大量單線態氧, 破壞內體/溶酶體的結構, 促進藥物的釋放。在常用的脂質納米顆粒核酸遞送系統中, 陽離子脂質被認為與內體逃逸密切相關。陽離子脂質一般是由一個極性頭部通過連接子和疏水的尾巴相連接。目前新一代的陽離子脂質包含了可降解的可離子化脂質, 其pKa值一般在6.0~7.0之間, 在生理條件下呈現電中性。當進入內體的酸性環境時, 可離子化脂質的頭部會被質子化, 帶上正電荷, 與內體膜上的陰離子脂質相互作用, 這一過程促使脂質體形成反六角相結構, 通過膜融合或膜破裂釋放有效載荷進入細胞質中。

近年來, 能夠繞過內體/溶酶體途徑的細胞攝取方式引起了廣泛關注, 其中外泌體包裹可以通過膜融合介導載體的攝取, 從而繞過內體/溶酶體途徑。研究發現, 直徑40~100nm的突觸小泡(一種脂質雙層結構)能通過與質膜融合來釋放神經遞質和激素, 這一過程主要由可溶性N-乙基馬來酰胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors, SNAREs)蛋白介導; 通過將SNAREs來源的跨膜片段syb(TMS-syb)插入人工脂質雙層, 成功模擬了突觸小泡的膜融合功能, 促進載體通過膜融合進入神經元, 繞過了內體/溶酶體途徑。You團隊發現由33個氨基酸組成的多肽pardaxin能夠介導脂質體通過小窩介導的內吞作用進入細胞并靶向內質網, 不僅避免了核酸藥物在內質體/溶酶體中被核酸酶降解, 還有利于pDNA或CRISPR/Cas9系統進入細胞核進行基因治療。

2.5 藥物釋放

核酸藥物通常在細胞質或細胞核中發揮作用, 其從載體上有效釋放是其發揮作用的前提。內體/溶酶體中的酸性微環境可以作為內源性刺激來促進核酸藥物釋放。Zhou等合成了(DPAx-co-DMAEMAy)-PG三嵌段pH敏感多聚陽離子, 將其組裝成膠束并通過靜電吸附siRNA。在酸性條件下, DPA由于質子化從疏水性轉變為親水性, 促使膠束降解并釋放siRNA。細胞內的各種酶也是藥物釋放的理想內源性刺激。例如酯酶就是一種廣泛存在于細胞質中的水解酶, 可以通過催化酯鍵的水解來介導化學藥物的釋放。在腦腫瘤細胞質中特異性高表達的谷胱甘肽(glutathione, GSH)可以通過還原效應促進核酸藥物的釋放。Wu等合成了對GSH敏感的嵌段共聚物, 通過GSH介導的二硫鍵斷裂, 促進了藥物的釋放。腫瘤和神經退行性疾病中活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平升高, 可以利用這一特點來刺激藥物的釋放。例如Liu等合成了帶有苯硼酸的正負電荷轉換聚合物, ROS可以降解苯硼酸, 從而將聚合物轉化為聚丙烯酸, 通過靜電排斥釋放DNA。此外, 通過膜融合直接將核酸藥物釋放到細胞質中也是一種高效且簡便的遞送策略。載體與細胞膜的直接相互作用是其核心機制, 通常通過電荷作用(載體通常帶有陽離子, 可以與帶負電的細胞膜相互吸引)或疏水性相互作用來觸發載體膜與細胞膜之間的相互作用, 促使磷脂雙層的重排和融合, 從而在無需進入內體/溶酶體的情況下釋放核酸藥物至細胞質。這種方法可以避免核酸藥物在內體/溶酶體內被核酸酶降解的風險, 提高了其在靶細胞內的穩定性和有效性。

 

3核酸藥物腦部遞送的途徑及其機制

3.1 繞過BBB的方式

3.1.1 鞘內注射和腦室內注射給藥

藥物中樞遞送的最直接方法是將藥物注射到腦脊液中。這種方式可繞過BBB, 提高藥物在大腦中的濃度并減少全身不良反應, 主要的給藥方式有鞘內注射(intrathecal, IT)和腦室內注射(intracerebroventricular, ICV)。IT給藥通過腰椎穿刺或植入鞘內藥物遞送裝置進行, 將藥物注入脊髓周圍的鞘內或蛛網膜下腔, 這種方法有助于藥物分布到脊髓、小腦和大腦表面, 是治療神經和神經肌肉疾病的ASO/siRNA最常用的給藥途徑。ICV給藥則是通過穿過顱骨將藥物注射到側腦室, 藥物通過腦脊液循環分布于整個大腦。兩種給藥方式廣泛應用于需要高濃度藥物在腦內的中樞神經系統疾病治療, 如腦腫瘤、神經退行性疾病和某些中樞神經系統感染等。

Nusinersen和tofersen是兩種已獲FDA批準的小核酸藥物, 均采用IT給藥的方式。它們屬于ASOs, 具有單鏈結構, 并在磷酸骨架中富含磷酸硫代(phosphorothioate, PS)修飾。PS修飾提高了寡核苷酸的穩定性和親脂性, 使其具有跨越細胞膜的能力, 增強了其在體內的分布和生物利用度。siRNA相比ASOs更為親水, 并帶有較多負電荷, 直接跨膜能力較弱, 需要通過化學手段提高其疏水性以用于局部注射。Alnylam公司的ALN-APP(alnylam amyloid precursor protein)是這一技術的代表分子。近期, 該公司公布了通過IT給藥ALN-APP治療AD和腦淀粉樣血管病(cerebral amyloid angiopathy, CAA)的I期臨床試驗的中期結果。ALN-APP采用C16脂肪酸鏈偶聯的方式, 增加了siRNA的疏水性, 輔助其跨越細胞膜, 從而發揮沉默靶基因的作用。APP基因的突變是導致早發性阿爾茨海默病和腦淀粉樣血管病的重要原因, 且淀粉樣蛋白沉積是阿爾茨海默病患者大腦的標志性特征之一。通過靶向編碼APP蛋白的mRNA, ALN-APP旨在降解mRNA, 減少APP蛋白的表達, 從而治療AD和CAA。初步結果顯示, 單劑量ALN-APP能在患者體內快速結合靶標, 并持續降低sAPPα和sAPPβ水平超過6個月。

3.1.2 鼻內給藥

與IT和ICV相比, 鼻內給藥(intranasally, IN)是一種非侵入性途徑, 主要通過嗅覺神經和三叉神經通路, 避開BBB將核酸藥物直接遞送到大腦。其中, 嗅覺神經是最重要的途徑, 利用其傳輸功能可有效繞過BBB。嗅覺通路主要以神經元外(神經細胞外間隙)轉運和神經元內(軸突內)轉運兩種方式將藥物遞送到CNS。前者是通過藥物在嗅覺神經束的細胞外間隙的擴散來實現的, 藥物分子可以在鼻黏膜上皮通過細胞外途徑進入, 然后通過嗅球進入大腦, 這種轉運方式的速度較快, 可以在幾分鐘到半小時內完成。后者則涉及藥物通過被動擴散、吸附性內吞和受體介導的內吞等細胞內機制進入細胞, 通過嗅覺神經元的軸突進行轉運。藥物分子在與嗅覺上皮的嗅覺感受神經元結合后, 可以沿著神經元的軸突進入大腦, 最終到達嗅球和其他腦區, 這種轉運方式的速度較慢, 可能需要數小時到數天。一旦藥物到達嗅球和腦脊液, 它們可以通過與腦細胞外液的混合進入CNS的其他區域。

三叉神經通路是實現鼻−腦藥物遞送的另一種途徑。藥物可以通過這一通路穿過呼吸和嗅覺上皮, 通過細胞內或細胞外的運輸機制沿三叉神經進入大腦。這種方式可以快速實現藥物從鼻腔到大腦的靶向治療。此外, 藥物還可以通過血液循環通路進入CNS。

具體來說, 藥物可以通過鼻腔黏液層、鼻上皮細胞層進入靜脈血流, 隨后穿透BBB進入CNS。經鼻給藥可快速直接進入CNS, 減少藥物在血液循環中的延遲和清除, 降低非靶向器官(如肝臟、脾臟和腎臟)的毒性風險。Rohn等通過非侵入性鼻腔遞送腺相關病毒9型(adeno-associated virus serotype9, AAV9)載體, 繞過BBB, 將CRISPR/Cas9基因編輯系統導入小鼠CNS, 成功下調了HTR2A基因表達, 顯著減少5HT-2A受體的表達, 改善了小鼠的焦慮行為。

目前, 鼻內給藥也存在一些挑戰: 需要最大化CNS滲透并最小化肺部暴露; 鼻纖毛的清除和酶活性會限制藥物在鼻腔中的停留時間和穩定性; 未修飾的核酸藥物易被鼻腔中的核酸酶降解或引發免疫反應; 鼻腔遞送只能進行低劑量給藥, 需要頻繁滴入; 存在劑量變化和個體吸收特性的差異等。為了克服這些挑戰, 研究者們正在探索納米載體的表面修飾和化學修飾, 以提高藥物的靶向遞送效率和內體逃逸能力。相關研究表明, 提高內體逃逸效率可以增加核苷酸藥物在細胞質中的濃度。盡管存在一些限制, 鼻腔給藥途徑憑借其直接的鼻腦轉運通路、豐富的血管分布、多孔的內皮基底膜及能夠繞過肝臟首過效應等優勢, 顯示出較高的臨床應用潛力。

3.1.3 對流增強遞送

對流增強遞送(convection-enhanced delivery, CED)是一種用于將藥物直接遞送到腦組織中的局部給藥技術。該方法通過在壓力梯度下持續注射藥物, 使藥物通過細胞間的空隙進入大腦組織, 從而繞過BBB, 實現高效的局部藥物遞送。Cohen等采用CED技術, 通過顱內注射(intracranial injection, IC)將透明質酸修飾的脂質納米顆粒直接遞送到腦部腫瘤位置。這些納米顆粒包裹著靶向PLK1基因的siRNA, 能夠選擇性結合腫瘤細胞上高表達的CD44受體, 從而實現特異性靶向作用。通過CED, 藥物可以繞過BBB, 在腫瘤部位形成高濃度藥物分布, 有效抑制PLK1表達, 促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤生長。

3.2 克服血腦屏障

3.2.1 物理方法

聚焦超聲(focused ultrasound, FUS)結合微氣泡(microbubble, MB)技術是一種非侵入性的物理手段。該技術通過將低頻超聲能量聚焦于特定腦區, 與預先注入血液循環中的MB協同作用, 短暫且局部地打開BBB。在超聲波的作用下, MB發生振蕩, 產生機械力作用于內皮細胞的緊密連接, 在約1~4h內創建一個藥物遞送窗口, 窗口在約24h后恢復。該過程能夠在不破壞神經組織的前提下, 促進核酸藥物的局部滲透。該方法的優勢在于其空間分辨率高, 可精確定位于目標腦區, 且BBB的打開是可逆的。Guo等探討了微氣泡增強的聚焦超聲(FUS-MB)結合50nm大小的陽離子脂質−聚合物混合納米顆粒能高效遞送siRNA到腦腫瘤微環境中, 顯著抑制Smoothened蛋白的表達, 并誘導腫瘤細胞凋亡。Kwak等通過FUS-MB暫時性地打開BBB, 使系統性注射的納米顆粒穿過BBB并精準遞送至目標腦區。研究中使用的聚(b-氨基酯)納米顆粒經過表面修飾, 能夠穩定包裹核酸藥物(如pDNA和mRNA), 并在神經膠質細胞和神經元中實現報告蛋白表達和CRISPR/Cas9基因編輯。同時磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)可以提供精確定位, MRI引導的FUS-MB能夠精確打開腫瘤和紋狀體區域的血腦屏障, 分別應用于治療膠質瘤和帕金森病。然而, FUS-MB可能因增加局部溫度及機械效應而損傷血管, 并允許有毒物質進入中樞神經系統, 因此需優化FUS參數以減少腦損傷。超短脈沖激光也能通過類似原理局部打開BBB且不破壞血管完整性。全腦高溫療法雖能提高BBB通透性, 但可能會對大腦造成嚴重的傷害, 包括細胞損傷和功能障礙, 具有潛在的嚴重不良反應和風險。

電穿孔技術通過在BBB上施加短暫的高強度電場, 誘導血管內皮細胞膜極化, 形成微小孔洞, 瞬時提高血腦屏障的通透性, 使得治療性核酸能夠進入腦組織, 促進核酸藥物的腦部遞送。更強、更長的電脈沖可以形成更多的孔, 從而得到更高的轉染速率, 但是這也可能導致外部介質擴散到細胞中, 增加毒性, 進而引起細胞死亡、組織損傷和炎癥反應等不良反應。因此, 在應用電穿孔技術時, 需要精確控制電場強度和脈沖時間等參數, 以平衡轉染效率和細胞損傷。

3.2.2 化學方法

此外, 一些生物和化學物質(如封閉帶毒素、組胺、緩激肽、油酸等)也可暫時打開BBB。Lexiscan是一種能夠短暫增強BBB通透性的化學物質, 它通過結合并激活血管內皮細胞上的腺苷A2A受體, 引起血管擴張并增加局部血流量, 暫時性地松解血腦屏障的緊密連接。這種機制使得血腦屏障的通透性短暫增強, 使大分子藥物或納米顆粒能夠更容易穿越屏障, 進入腦組織進行治療。Lexiscan的作用是短暫且可逆的, 能夠增加藥物在腦部靶向區域的滲透和累積, 尤其在腦腫瘤(如膠質母細胞瘤)的治療中, 顯著提高了遞送效率。

3.3 跨越BBB

親脂性藥物和一些特殊設計的藥物可通過跨細胞轉運途徑穿過BBB。這包括通過血管內皮細胞的內吞作用、囊泡運輸和外排作用等。跨細胞途徑允許藥物直接穿過細胞膜, 是一種更為有效的藥物遞送方式, 具有更大的潛力。它可分為3個不同的類別: 受體介導的轉運(receptor-mediated transcytosis, RMT)、載體蛋白介導的轉運(carrier-mediated transcytosis, CMT)和吸收介導的轉運(adsorptive-mediated transcytosis, AMT)。RMT通過特定受體介導的通路進行核酸藥物的轉運。跨越BBB的RMT過程需要配體與其在腦微血管和毛細血管內皮細胞腔膜上的同源受體結合, 并確保靶受體蛋白在腦血管內皮細胞中高表達, 而在外周血管中最低表達, 從而實現藥物的有效遞送。CMT通過特定的膜載體蛋白介導核酸藥物跨BBB轉運; 而AMT則通過富含精氨酸或賴氨酸等陽離子氨基酸的細胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)經靜電吸附內皮細胞來增強BBB通透性。

3.3.1 受體介導的胞吞轉運

在受體介導的轉胞吞作用中, 特定的配體與內皮細胞管腔側的特異性受體結合, 觸發內吞作用形成轉胞囊泡, 轉運到大腦。這種方法是研究最廣泛的腦遞送途徑。常見的受體包括轉鐵蛋白受體(targeting transferrin receptor, TFR)、煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)、胰島素受體、低密度脂蛋白受體相關蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein, LRP)等。

3.3.1.1 TFR

TFR在腦毛細血管內皮細胞表面高度表達, 通過受體介導的內吞作用內化轉鐵蛋白結合的鐵。大多數用于RMT的配體是序列特異性肽, 它們因合成成本低且易于大規模生產而受到青睞。同時這些肽還具有氨基、羧基和巰基等反應性基團, 可以在溫和反應條件下將其化學修飾到納米粒子表面。目前已開發出一種標準的載體修飾肽方法, 即通過Michael加成反應, 將特定序列肽的半胱氨酸修飾后共價附著到馬來酰亞胺修飾的納米粒子上。特定序列肽如T7(HAIYPRH)、TBP(GGGHKYLRW)等已被開發出來, 它們可以通過特異性結合BBB上的轉鐵蛋白受體來增加核酸藥物在大腦中的積累。

靶向BBB上的轉鐵蛋白受體還可以通過在納米顆粒表面修飾80kDa的轉鐵蛋白來實現。許多研究表明, 結合有轉鐵蛋白的納米系統能夠通過蛋白受體結合和隨后轉鐵蛋白受體介導的轉胞吞作用有效地穿越BBB, 將藥物遞送到大腦。Rodrigues等開發了轉鐵蛋白修飾的納米系統, 用于將核酸治療物遞送至大腦。他們首次開發了一種雙配體功能化, 與CPP滲透素(penetratin, Pen)和轉鐵蛋白結合的脂質體載體, 以跨BBB遞送pDNA, 在體外BBB模型(由腦內皮細胞bEnd.3和大鼠原代星形膠質細胞構建)中, 雙配體脂質體的效率顯著高于單配體脂質體(7%對比3%GFP陽性神經元)。體內研究顯示, 相比于未結合或單一配體功能化脂質體。靜脈注射的雙配體脂質體在小鼠大腦中轉染效率更高。Rodrigues等后來擴展了他們早期的工作, 在小鼠AD模型中測試了這些腦靶向CPP-轉鐵蛋白脂質體的治療潛力和有效性, 研究發現, 靜脈注射負載神經生長因子基因pDNA的CPP-轉鐵蛋白脂質體顯著減少了AD小鼠腦中的Aβ沉積。

3.3.1.2 nAChR

nAChR在中樞神經系統中高度表達且分布廣泛, 可以利用其相關的配體通過RMT實現腦靶向。例如來自狂犬病毒糖蛋白的RVG肽含有29個氨基酸, 可以結合腦毛細血管內皮細胞和神經元上的nAChR。RVG肽可以誘導受體介導的轉胞吞作用, 穿透BBB, 最終將生物制劑運輸到腦實質, 目前已成功作為靶向大腦的配體, 用于遞送小分子藥物、siRNA和蛋白質進行診斷和/或治療, 適用于各種疾病, 如多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)、創傷性腦損傷和AD等。

Shen等報道RVG肽能夠促進CRISPR/Cas9遞送至大腦, 他們介紹了一種通過一步合成法構建的可追蹤納米生物雜化復合物(fluorescent traceable biohybrid iron oxide, F-TBIO), 用于AD的CRISPR/Cas9基因編輯與化學藥物協同治療。F-TBIO由超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticle, SPION)核心構建, 并與聚賴氨酸-PEG連接, 末端為RVG或氟伐他汀。這些納米系統能夠穿越BBB并靶向神經元, 有效遞送CRISPR/Cas9基因編輯器和藥物。體內研究表明, 該系統可以顯著減少AD小鼠海馬體中的Ab斑塊面積, 并改善其認知能力。同時, F-TBIO具有良好的MRI成像性能, 能在復雜的腦生理環境中提供準確的成像信號, 展示了其作為神經退行性疾病治療平臺的巨大潛力。

3.3.1.3 LRP

LRP(如LRP1和LRP2)在中樞神經系統(包括腦內皮細胞和GBM細胞)中高度表達, 介導的多種配體[包括載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)和某些神經保護因子], 被廣泛用于研究神經退行性疾病的藥物遞送。Angiopep-2(Ang, TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC)是靶向LRP1的最具代表性的肽, 其序列是基于阿普羅汀及其他具有Kunitz型結構域的LRP1結合蛋白的序列比對而設計的。Angiopep-2能夠促進藥物穿越BBB并靶向膠質瘤細胞, 已被廣泛應用于治療GBM。Zou等研究開發了一種高效封裝CRISPR/Cas9的納米膠囊, 通過系統給藥實現對GBM的非侵入性靶向治療。這些納米膠囊采用原位聚合方法, 在GSH降解的聚合物殼內封裝Cas9/sgRNA RNP, 通過使用Angiopep-2肽作為靶向配體, Cas9RNP納米膠囊在GBM小鼠模型中展現了明顯的腫瘤靶向能力(11.8%ID·g-1)和高效的PLK1基因編輯效果(Sanger測序顯示28.6%的插入/缺失率), 將攜帶腫瘤小鼠的中位生存時間從24天延長至68天。此外, Angiopep-2肽的修飾使納米顆粒能夠高效穿越BBB并在腦腫瘤中積累(12.9%ID·g-1)。在GBM小鼠模型中, Cas9介導的PLK1基因敲除有效抑制了腫瘤生長, 將小鼠的中位生存時間從18天(PBS處理)延長至40天, 同時幾乎沒有不良反應。

3.3.2 載體蛋白介導的胞吞轉運

CMT是通過特定的膜載體蛋白在逆濃度梯度中將藥物運過BBB。BBB內皮細胞含有多種特異性轉運蛋白, 如葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter type1, GLUT1)、氨基酸轉運蛋白(L-type amino acid transporter1, LAT1)、核苷轉運蛋白等神經遞質、維生素和脂肪酸的轉運蛋白。這些轉運蛋白通常位于內皮細胞的頂端和基底側膜上。藥物被設計成類似于這些天然底物(如葡萄糖、氨基酸等)的分子, 這樣轉運蛋白能夠識別并結合這些藥物分子。當轉運蛋白識別并結合藥物分子以后, 其構象會發生變化, 能夠將藥物從血液一側轉運到腦內一側。由此可見改變納米顆粒上的某些轉運蛋白或其類似物是增加納米顆粒BBB滲透性的有效方法。

GLUT1是一種己糖轉運蛋白。Na離子濃度差異驅動D-葡萄糖、L-抗壞血酸及其衍生物通過GLUT1從血液轉運到大腦。Zhou等開發了一種半乳糖修飾的兩親性聚合物膠束系統包載siRNA藥物(Gal-NP@siRNA), 該系統通過血糖控制的GLUT1介導的轉運高效穿越BBB。研究表明, Gal-NP@siRNA系統在AD小鼠模型中顯著降低了BACE1的表達, 減少了淀粉樣斑塊, 并改善了認知功能, 同時未顯示出顯著的不良反應, 展示了其在中樞神經系統疾病治療中的巨大潛力。

3.3.3 吸附介導的胞吞轉運

AMT提供了一種通過細胞吸附和胞吞作用將物質跨越BBB向大腦遞送藥物的方法。其相關機制是帶正電的蛋白質、肽或分子與BBB細胞內腔側的負電糖萼和細胞膜發生靜電相互作用, 觸發內吞作用, 形成跨胞吞噬小泡。這些小泡移動到BBB細胞的外腔膜, 融合并釋放分子進入大腦。

富含陽離子氨基酸(如精氨酸或賴氨酸)的CPPs可通過與內皮細胞的靜電吸附增強BBB的通透性。Yao等研究了一種新型基因遞送系統，用于BBB治療膠質瘤。該系統基于樹枝狀聚賴氨酸(dendrigraft poly-L-lysines, DGL)和PEG結合的細胞穿透肽(LIM kinase2nucleolar translocation peptide, LNP) LIM激酶2核仁轉運信號序列。基因治療載體(DGL-PEG-LNP)封裝了編碼生長抑制因子基因的pDNA。研究結果表明, 該遞送系統能夠有效穿越BBB, 增強細胞攝取, 并促進腫瘤細胞內的基因表達。LNP修飾的納米顆粒(DGL-PEG-LNP/DNA)在膠質瘤小鼠模型中顯示出顯著的腫瘤細胞凋亡效果, 并且與其他治療相比, 顯著延長了膠質瘤小鼠的中位生存時間。Chen等設計了用于將CRISPR/Cas9基因組編輯器遞送到大腦的脂質體模板水凝膠納米顆粒(liposome-templated hydrogel nanoparticles, LHNPs)。LHNP修飾了iRGD和mHph3CPPs以增強細胞內遞送效率, 使其在腦腫瘤中的積累比未修飾的LHNP高出2.6倍。但同時利用CPPs進行修飾可能會促進藥物在全身給藥后被不適當的細胞吸收, 從而產生不良反應。此外, CPPs的正電荷還可能加速納米顆粒在血液循環中的清除。因此, 應謹慎考慮在全身給藥中應用CPPs。

 

4核酸藥物的腦部遞送策略及其應用

核酸藥物的強負電荷和對核酸酶降解的易感性限制了它們被局灶細胞吸收, 臨床應用面臨穩定性差、靶向性弱、難以跨越體內屏障等難題。不同類型的核酸具有不同的分子結構和分子質量, 因此需要不同的裝載策略: 小的核酸藥物, 如siRNA、miRNA和ASOs, 可以通過核酸化學結構修飾來提高其在體內的穩定性和靶向性, 并與配體分子偶聯以促進其在病灶內的積累, 提高遞送效率, 同時降低藥物的免疫原性; 而分子質量相對較大的核酸藥物, 如mRNA和pDNA, 難以進行化學修飾, 易于通過具有較大空間的載體進行裝載和體內遞送, 目前應用較多的遞送載體有病毒載體、聚合物納米載體、脂質納米顆粒、無機納米載體、蛋白載體、外泌體等。這些載體不僅幫助藥物到達病灶, 還促進核酸類藥物實現更高效的內體逃逸, 從而在體內更好地發揮作用。向大腦遞送核酸的理想載體應具有生物相容性、穩定性和有效的細胞攝取等特殊特性。穿過血腦屏障的擴散主要取決于血腦屏障兩側藥物的親脂性、表面電荷、相對分子質量和濃度梯度。不同載體在核酸藥物腦部遞送方面的應用情況如表2所示。

4.1 病毒載體

到目前為止, 已經創建了用于全身遞送的病毒和非病毒載體。病毒載體, 包括腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)、腺病毒、慢病毒、逆轉錄病毒和單純皰疹病毒, 已被開發并用于中樞神經系統疾病的臨床前和臨床基因治療。研究發現, 病毒可以通過不同的機制穿越BBB(圖3A), 如AAV通過與神經血管內皮細胞上的表面蛋白結合進入腦實質, 觸發受體介導的轉吞作用, 可以轉導神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞和內皮細胞, 并且能夠在神經細胞中長期表達。人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)可以感染單核細胞并利用其作為特洛伊木馬來穿越血腦屏障。BBB外感覺和運動神經元是狂犬病毒等病毒的另一入口, 他們結合神經肌肉連接處的神經元并利用軸突運輸系統進行逆行運輸。基于此已經開發了幾種基于病毒顆粒遞送治療性核酸的方法。2012年歐洲藥品管理局(European Medicines Agency, EMA)批準了首個基于AAV方法的基因治療產品Glybera, 展示了AAV載體的理想安全性和巨大應用潛力。而第一個成功治療中樞神經系統疾病的基于AAV的基因療法是onasemnogene abeparvovec (Zolgensma), 該療法已被FDA批準用于治療年齡小于2歲的SMA兒童患者(NCT03955679)。

Figure 3 Different types of nucleic acid delivery methods. A: Different pathways of viral vectors entry into CNS. Created in https://www.BioRender.com; B: Modification of nucleic acid drugs; C:The schematic illustrations of the lipid-based nanoparticles[153]. Adapted from Ref. 153 with permission; D: Schematic representation of the structure of nanocapsules and nanospheres (arrow stands for the presence of drug/bioactive within the nanoparticles)[162]. Adapted from Ref. 162 with permission; E: Scheme of exosome biogenesis and secretion (left), molecular constituents of the exosomes (right)[172]. Adapted from Ref. 172 with permission; F: Endogenous loading and exogenous loading of material engineering exosomes[180]. Adapted from Ref. 180 with permission

 

基于病毒的載體目前主要用于基因治療, 并且通常依賴于侵入性遞送(如IT)。這些方法存在一些問題, 包括免疫反應可能導致的藥物降效、病毒載體的安全性風險及對正常細胞的影響、傳遞效率不穩定、生產和規模化困難, 以及可能引發基因編輯問題。

4.2 核酸藥物結構改造

通過對核酸藥物進行結構改造, 借助化學修飾手段將親脂性分子引入核酸主鏈, 或采用配體偶聯方式將多肽小分子配體等與核酸主鏈相連(圖3B), 可使得到的核酸藥物具有明確且單一的分子結構, 顯著增強其穩定性, 并有效降低批次間差異。同時通過這些改造策略提升藥物的細胞攝取效率及在特定靶組織或細胞的富集能力, 有利于核酸藥物的臨床轉化。

由于小核酸藥物通常帶有負電荷且極性較強, 在穿膜或跨越BBB時面臨巨大挑戰, 通過引入親脂性基團可改善核酸藥物的脂溶性, 從而在肝外組織(包括中樞神經系統)實現更有效的遞送。例如, Brown等研究發現, 2′-O-十六烷基(C16)修飾的siRNA可在嚙齒類和非人靈長類動物中實現持續且高效的基因沉默。在AD小鼠模型中的進一步研究表明, C16-siRNA能靶向淀粉樣前體蛋白, 有效改善實驗動物的行為及生理缺陷。除十六烷基外, 膽固醇的環狀結構也常用于核酸修飾, 并被認為較直鏈脂肪酸更具親脂性。Nagata等將膽固醇或a-生育酚偶聯于DNA/RNA異源雙鏈寡核苷酸(heteroduplex oligonucleotides, HDO)后, 通過靜脈或皮下給藥可使其更容易跨越BBB, 在中樞神經系統中廣泛分布并實現對靶基因高達90%的抑制率, 大大優于傳統單鏈ASOs。

在提升細胞攝取與逃逸效率方面, CPPs帶有正電荷或疏水性基團, 可增強藥物與細胞膜的相互作用并促進內吞, 部分CPP還能在內體酸化環境中破壞或改變內體膜結構, 實現內體/溶酶體逃逸, 有效避免藥物降解。與此同時, 若偶聯分子能夠識別并結合BBB上高表達的受體, 則可通過RMT將藥物遞送至中樞神經系統。Dastpeyman等將CPP HA2-ApoE(131~150)與抗SMA藥物諾西那生(nusinersen)偶聯, 通過HA2-ApoE與LDLR的相互作用觸發RMT, 實現腦部遞送, 在SMN2轉基因小鼠模型中, 這種偶聯物通過系統給藥顯著增加了大腦和脊髓中完整SMN2蛋白的水平, 表明了其高效的內體逃逸及BBB跨越能力。

此外, 葉酸(folic acid, FA)修飾是典型的小分子配體修飾方式之一, 它在早期神經元發育和分化中起著重要作用, 包括膠質母細胞瘤在內的各種癌細胞類型, 都表達高水平的葉酸受體。通過內吞作用輔助藥物穿越細胞膜, 并與腫瘤細胞或BBB上的葉酸受體結合, 葉酸修飾可實現核酸藥物的靶向富集。Lee等構建了含有抗miR-21鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)序列的多價葉酸, 三向結(three-way-junction, 3WJ) RNA納米粒子, 遞送抗miR-21LNA到膠質母細胞瘤細胞。通過靜脈注射FA-3WJ-LNA-miR21, 有效地降低了miR-21的表達, 從而恢復了腫瘤抑制因子PTEN和PDCD4的功能, 使得膠質母細胞瘤細胞凋亡和腫瘤生長抑制, 顯著提高了小鼠的總體生存率。

綜上可見, 化學修飾或配體偶聯后的核酸藥物不僅具備結構可控、成分單一、親脂性可調等優勢, 也能更好地應對快速腎臟清除及內吞體/溶酶體逃逸等挑戰; 若再結合血腦屏障跨越策略或特異性配體靶向機制, 則有望進一步提高核酸藥物在多種疾病模型中的治療效率和安全性, 為后續臨床轉化奠定基礎。

4.3 脂質納米顆粒

脂質類是核酸藥物遞送中應用最廣泛的一類遞送系統, 包括脂質體(liposome)、脂質體復合物(lipoplex, LP)、脂質納米顆粒(lipid nanoparticle, LNP)等, 目前研究中用得較多的為含有可離子化脂質的LNP。LNP一般包括可電離的陽離子磷脂(ionizable lipids)、中性輔助磷脂(helper lipids)、膽固醇、聚乙二醇修飾的磷脂(PEGylated lipid)等4種主要成分(圖3C)。

脂質納米顆粒由于其尺寸小并且具有親脂性而容易被大腦吸收, 這同時也延長了它們在血液中的循環時間并且更容易通過BBB運輸。然而當靜脈注射LNP時, 血流中吸附在納米顆粒表面的血清蛋白冠通過ApoE受體介導的攝取會將其靶向肝臟。針對這一問題, 研究人員通過對LNP進行修飾及設計相關的脂類納米顆粒系統, 來改善其對BBB的遞送。例如Su等制備了DPMT@PEI/miR-195納米脂質體, 通過P-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷(P-aminophenyl-alpha-D-mannopyranoside, MAN)和陽離子細胞穿透肽(cell penetrating peptide, TAT)雙重修飾進行工程改造, 該脂質體表現出增強的BBB和細胞膜穿透能力。在APP/PS1小鼠模型中, 與多奈哌齊和阿杜那單抗相比, 通過尾靜脈注射給藥的DPMT@PEI/miR-195顯示出更好的治療效果, 能有效改善認知功能, 并減輕Aβ、tau蛋白過度磷酸化和小膠質細胞極化。

目前研究人員發現通過局部或鼻內給藥的LNP能成功轉染特定的細胞類型, 例如大腦內的小膠質細胞, 神經元和星形膠質細胞等。Cohen等研究發現, 通過顱內注射(intracerebral injection, IC)透明質酸功能化的LNP能成功幫助將siRNA遞送至小鼠神經膠質瘤。Palanki等使用可電離脂質納米顆粒作為遞送平臺, 通過腦室內注射, 篩選出一種在圍產期大腦中具有比FDA批準的行業標準LNP更強的功能性mRNA遞送能力的LNP配方(C3LNP), 并通過進一步的優化使其能夠改善新生小鼠大腦中溶酶體貯積病的生化表型。Ralvenius等優化改進了一種新型脂質納米顆粒—先導小膠質細胞LNP, 腹腔注射和局部腦室內注射的方式都使其能夠安全、高效靶向小膠質細胞, LNP介導的靶向PU.1轉錄因子(已知的AD風險位點)的siRNA遞送成功地降低了人誘導多能干細胞來源的小膠質樣細胞(induced microglia-like cells, iMGL)中的PU.1水平, 并減少了注射LPS的小鼠和CK-p25小鼠的神經炎癥。但是像腦室內注射這些局部給藥的方式往往是具有侵入性的, 因此現在一些研究也采用與非侵入性方法結合, 實現藥物成功穿越血腦屏障, 治療中樞神經系統相關疾病。Zhao等設計一種新型復合物MB-shBirc5-lipo-NGR, 結合FUS, 可誘導非侵入性、可逆、局部BBB通透性, 通過實驗證明了FUS輔助的MB-shBirc5-lipo-NGR可以打開BBB并抑制膠質瘤生長。

LNP具有親水和疏水區域, 并且表面電荷可調, 使其能夠封裝各種理化性質不同的藥物。這種多功能性允許在同一個納米顆粒中共同封裝不同類型的藥物。在設計LNP時, 研究者不斷優化脂質的化學結構, 以提高其在體內的穩定性和靶向性。例如, 通過改變脂質尾部的飽和度和連接子的化學結構, 可以調節LNP的流動性和內體逃逸能力。此外, 研究人員也在探索如何通過LNP表面修飾來提高其靶向特定細胞或組織的能力, 以及如何通過控制LNP的粒徑和表面電荷來優化其在體內的生物分布和清除率。相比于病毒載體, 使用LNP遞送核酸藥物時可以有效規避感染、致癌及免疫原性等風險, 能有效保護核酸藥物免受降解。同時通過添加輔料, LNP可以協助免疫激活和潛在的免疫應答, 進一步增強免疫效果。鑒于LNP在安全性和有效性方面的優勢, 它們已成為藥物遞送和疫苗設計中的首選載體之一。并且LNP的安全性和有效性已得到了監管機構的廣泛認可, 目前已成為FDA批準最多的藥物載體類別。

盡管有這些優勢, LNP仍面臨一些挑戰, 如容易被網狀內皮系統快速吸收, 導致其在肝臟和脾臟中積累, 這不僅減少了核酸藥物的可用性, 還增加了這些器官的負擔。此外, LNP從內體和溶酶體中逃逸的能力有限, 嚴重影響了核酸藥物的轉染效率, 這也是當前LNP開發的關鍵關注點。

4.4 聚合物納米載體

聚合物納米顆粒(polymeric nanoparticles, PNPs)是一種尺寸在1~1000nm的納米材料。通常有納米膠囊和納米球兩種形態結構, 納米膠囊是一種囊狀結構, 具有被聚合物膜或殼包裹的空腔, 可以控制其中的藥物釋放; 與納米膠囊不同, 納米球是一種固體顆粒系統, 藥物或被包裹在構成納米球的聚合物基質中, 或被吸附在顆粒表面(圖3D)。納米球的設計可以使藥物從基質或表面逐漸釋放出來, 從而實現藥物的持續釋放。在遞送核酸藥物的應用中, 聚合物納米顆粒發揮了重要作用。它們通常是聚合物和核酸藥物通常通過靜電、疏水或氫鍵相互作用而形成的納米顆粒。可以被分為多聚物、聚合體和樹枝狀大分子等幾個亞類。

多聚物包含陽離子聚合物, 通過靜電相互作用與核酸結合并凝聚成小而緊密的結構, 該凝聚過程是由熵驅動的, 當陽離子聚合物與核酸混合時, 多聚物自發產生。此方法可以產生表面帶正電荷的顆粒, 并更好地將核酸凝聚成更小尺寸的納米顆粒。該策略可以提高核酸藥物的穩定性和細胞攝取效率。其中PEI具有高密度的正電荷, 能夠實現高效的核酸藥物裝載及通過質子海綿效應逃逸內體/溶酶體。Rytblat等通過PEI的靜電吸附增強了抗miR-125b ASO在膠質瘤細胞中的攝取和內體逃逸。MiR-125b在GBM細胞中的表達上調, 并通過促進細胞增殖和抑制凋亡, 在GBM細胞中發揮致癌效應。Sheikh等的研究顯示, 聚賴氨酸修飾的PEI(PLys-PEI)和PEI相比, 明顯提高了核酸藥物的轉染效率, 同時降低了PNPs的毒性。通過將PLys-PEI與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) pDNA相結合, 借助立體定位引導實施腦內注射, 發現負載有VEGF pDNA的PNP能夠在神經元中實現高效轉染, 顯示出其在PD基因治療領域的潛力。

聚合體是由兩親性嵌合共聚物制成的聚合物囊泡, 通過疏水效應自組裝形成具有親水核心和疏水涂層的納米球, 具有親水性的各種核酸(例如pDNA, ASO和siRNA)可以被有效地封裝到聚合物囊泡內部的水核中。例如Pangburn等發現由聚(1, 2-丁二烯)-b-聚(環氧乙烷)嵌段共聚物自組裝形成的聚合體, 可以用作siRNA的遞送系統, 包封率約為51%。

樹枝狀大分子是由通過迭代的反應步驟, 在每次生長中增加分支, 形成具有樹枝狀結構的聚合物, 包含內核、重復單元和表面功能化3個部分。隨著支化程度的增加, 最終形成封閉的三維球體, 內藏空腔結構, 表面可以通過將不同分子與反應性末端基團偶聯來實現功能化。最常見的樹枝狀大分子有聚酰胺-胺(polyamidoamine, PAMAM)、聚賴氨酸[poly(L-lysine), PLL]、聚丙烯亞胺[poly(propylene imine), PPI]等。Kim等使用可生物降解的PAMAM樹枝狀聚合物e-PAM-R包載編碼高遷移率蛋白(high mobility group box protein1, HMGB1)的siRNA, 發現經鼻遞送的HMGB1siRNA能通過下調HMGB1表達, 抑制缺血后大鼠腦梗死體積, 并有助于神經和行為缺陷的恢復。Cai等設計了一種基于樹突狀結構DGL的siRNA和D肽(D peptide, Dp)負載的納米顆粒, 能夠靶向并穿透BBB, 進入腦實質, 并在AD病變處積累。通過特異性靶向BBB上的轉鐵蛋白受體的T7肽和可酸裂解的長聚乙二醇, 實現高內化和有效的轉胞吞作用。專門針對患病神經元的Tet1通過短PEG修飾為DGL, 驅動納米顆粒到AD病灶并釋放藥物, 最終抑制了Aβ的產生, 緩解了Aβ斑塊和tau蛋白磷酸化(p-tau)纏結誘導的神經毒性, 顯著提高了AD小鼠的認知能力。

目前研究發現通過血腦屏障效率高度依賴于PNPs的物理化學特性。聚合物納米顆粒提供了一種可調控的藥物釋放和降解特性, 通過改變其大小和表面電荷, 或者通過使用特定的修飾和靶向基團可以改善PNPs的血液循環時間、生物分布和穿透BBB的能力, 進一步增強其遞送效率和細胞攝取率。

4.5 外泌體

近年來, 外泌體在核酸藥物遞送領域引起了廣泛關注, 其獨特的內源性生物學特性為多種治療性核酸(如siRNA、miRNA、mRNA和ASO等)的精準、高效運輸提供了新的策略。外泌體是一種異質性的內源細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs), 幾乎可以由所有的細胞產生, 直徑約為30~150nm, 具有脂質雙層膜結構, 膜上附著有黏附分子間質, 主要組織相容性復合體和多種蛋白質(四跨膜蛋、熱休克蛋白、免疫調節蛋白等), 內腔含有多種多肽、核酸、氨基酸和代謝物等(圖3E)。作為細胞間通訊的關鍵參與者, 外泌體既可通過表面配體直接接觸并激活受體細胞, 也可通過內吞作用將核酸、蛋白質和脂質在內的多種生物活性分子從供體細胞轉移到受體細胞, 發揮信號轉導作用。

外泌體具有良好的生物相容性和較低的免疫原性, 能夠在細胞間傳遞核酸、蛋白等信號分子。在跨越BBB和實現腦靶向遞送方面, 外泌體展現出了獨特的優勢, 其表面配體與大腦內皮細胞受體之間的相互作用被認為是外泌體腦靶向的主要機制。研究表明, 源自內皮細胞和樹突狀細胞的外泌體能夠攜帶小分子藥物和siRNA穿過血腦屏障。在小鼠卒中模型中, 與間充質干細胞衍生的EV相比, 神經干細胞衍生的EV顯示出優先的大腦靶向。然而, 外泌體在實際應用中仍面臨一些挑戰, 其生產和純化過程復雜、產量低且穩定性差, 限制了大規模的生產和應用; 體內靶向性不夠明確, 遞送效率仍然有限, 影響了其治療效果的發揮。

為了增強外泌體遞送能力并克服其固有局限, 研究人員基于仿生理念, 將多種工程技術與外泌體的天然生物學特性融合, 開發工程化外泌體。通過基因工程和納米工程技術等實現外泌體規模化生產和高效純化, 并引入促穩定成分和特殊包覆技術增強其穩定性, 防止內部大分子荷載的降解或失活。同時, 表面修飾特定配體, 提高靶向性, 確保藥物或基因精準遞送至目標細胞, 提升治療效果并減少不良反應。例如Alvarez-Erviti等發現通過靜脈注射經過神經元特異性RVG肽修飾低免疫刺激性的樹突狀細胞來源的外泌體, 成功將GAPDH siRNA特異性地遞送至大腦中的神經元、小膠質細胞和少突膠質細胞, 實現了特異性基因敲低, 且重復注射不影響效果; RVG外泌體遞送BACE1 siRNA可顯著降低阿爾茨海默病治療靶點BACE1的mRNA和蛋白水平, 減少Aβ1-42水平, 且未引起明顯免疫反應。

相關的外泌體遞送系統主要通過內源性和外源性兩種載藥方式載帶核酸藥物(圖3F)。其中內源性加載是指通過基因工程、代謝標記和外源導入等策略對親本細胞進行特異性修飾, 從而使得這些細胞分泌的外泌體攜載需要遞送的藥物。常用細胞轉染的內源性方式將核酸藥物加載到外泌體中, 其優點是保留了外泌體的生物功能及其完整性, 但它同時需要復雜的操作步驟, 實驗周期較長, 制備成本較高。外源性加載則是在分離和收集外泌體后采用共孵育、電穿孔、超聲處理、反復凍融、共擠出等技術, 在外泌體表面或者內腔修飾和裝載所需藥物或者靶向試劑, 相對來說更具有靈活性, 并且可以通過針對特定靶標的定向性修飾來提高靶向性。然而, 外源性藥物裝載也可能會面臨外泌體的完整性被破壞, 有未被捕獲的藥物需要額外的步驟來除去等問題。

將治療性外泌體遞送到靶細胞有被動靶向和主動靶向兩種方式, 其中的被動靶向是指不同類型的天然外泌體可以黏附不同的細胞, 具有來源于供體細胞的天然靶向能力。而主動靶向則利用各種技術方法通過外泌體表面工程實現外泌體的靶向遞送。

外泌體在腦部核酸藥物遞送方面具有極大的潛力, 雖然目前像脂質體、聚合物納米顆粒等制劑都可以利用其納米尺寸跨越血腦屏障來實現核酸藥物的腦靶向遞送, 但會存在血液毒性和機體內蓄積的問題; 而本身就具有穿透血腦屏障的內源性外泌體具有更低的毒性和免疫原性, 生物相容度高, 血液循環穩定性和組織選擇性好, 并且可以對其進行復雜的工程化改造, 是一種具有發展潛力的腦部核酸藥物遞送體系。

 

5展望與挑戰

核酸藥物, 包括siRNA、miRNA、ASOs、mRNA、pDNA和CRISPR/Cas系統, 以其在基因水平上的精準調控, 革新了神經系統疾病的治療思路, 也為更多健康問題的解決提供了新的機會。它們能夠精確調控基因表達, 為神經退行性疾病、腦部腫瘤和腦血管疾病等復雜疾病提供了新的治療方法。隨著生物醫學技術的不斷進步, 核酸藥物已經成為21世紀生物技術革命的前沿, 它們不僅補充了傳統藥物, 還代表著生物治療方式從“被動控制”向“主動干預”的范式轉移: 通過精準調控基因表達, 直接干預疾病的發生和發展, 從根本上改變疾病的進程。核酸藥物的成功應用有望從分子和細胞層面重塑疾病的病理機制, 為遺傳性和后天性腦部疾病的治療帶來進一步突破。

然而, 要實現核酸藥物的有效應用, 必須克服BBB這一生理障礙。盡管BBB作為大腦的生理防護系統能有效阻擋有害物質入侵, 但同時也限制了治療性大分子藥物的進入。為突破這一瓶頸, 科研人員開發了多種創新策略, 包括利用超聲波和電穿孔等物理方法暫時性地增加BBB的通透性, 以及開發病毒載體、LNP、聚合物納米顆粒和生物源性外泌體等多樣化遞送系統。這些遞送系統各具特色, 展現了不同的優勢, 也面臨著各自的挑戰: 病毒載體可能引發安全隱患, LNP可能誘發免疫反應, 而外泌體則存在規模化生產困難等問題。為了解決這些問題, 研究者不僅致力于優化現有遞送系統的效率, 還不斷創新, 通過生物工程手段對遞送載體進行表面修飾和功能化設計, 以增強其在穿越BBB時的靶向性和生物相容性。例如, 表面修飾靶向分子或肽類, 可以幫助遞送系統更有效地穿越BBB, 并將核酸藥物遞送到特定的腦區或細胞。同時, 還在開發多功能納米載體, 這些載體集成了靶向、響應性釋放和成像功能, 能夠實現更精準的遞送和實時監控。

這些技術的進步不僅為核酸藥物的遞送開辟了新途徑, 也在重塑藥物遞送的未來, 推動中樞神經系統疾病治療向精準醫學邁進。核酸藥物的應用標志著藥物開發領域的革命性突破, 并體現了醫學科學向跨學科融合和個性化治療策略的重要轉型。隨著遞送技術的不斷優化和創新, 核酸藥物有望在更廣泛的醫療領域發揮作用, 推動疾病治療范式從“控制癥狀”向“精準治愈”轉變, 為人類健康開辟新的前沿。