除了對每批次的單克隆抗體進行常規的放行檢測之外，對使用臨床試驗樣品生產工藝生產的產品進行進一步的生物化學和生物物理學上的表征，對于全面了解單克隆抗體產品的詳細結構 特征，并鑒定關鍵質量屬性是至關重要的。這些詳細的表征數據還可以用于支持產品制劑處方的 開發，有助于證明工藝放大、工藝變更或者廠房變更后的產品可比性。不需要對每批次的單克隆抗體都進行表征研究，而且本文中所述的分析方法也并非都需要在臨床I 期研究之前進行。

用于表征單克隆抗體產品的分析方法應盡可能完整的描述產品的結構和變化。從表4.9 中 列出的常用的表征單克隆抗體產品的分析方法的清單中可以看出，某些分析方法既可以用于產品 的表征，也可以用于放行測試。比如，肽圖分析可以用作常規的鑒定測試，因為它可以確證單克 隆抗體產品的一級結構。同時，肽圖還可以提供有關單克隆抗體的更為詳細的表征信息，比如抗 體中二硫鍵的確認，是否存在降解產物，如蛋白質的氧化或者脫酰胺形式，以及各種翻譯后的位 置和結構修飾，比如糖基化。另一種常用于放行和表征的分析方法是質譜分析。除了確認正確的 分子量，蛋白序列和翻譯后修飾之外，質譜分析還可以用于鑒定單克隆抗體存在其他產品相關或 者不相關的蛋白，并為肽圖分析確定的產品結構信息提供正交的確認。

1 蛋白結構的表征

1.1 氨基酸序列分析

氨基酸分析可以鑒定和定量蛋白質樣品中存在的大多數的氨基酸，樣品通常要經過酸水解 法破壞各個氨基酸之間的肽鍵。酸水解通常使用6 N 的鹽酸在100℃下處理16-24 小時。釋放單 個氨基酸后，可以在色譜分離之前或者之后進行衍生化，然后進行在線檢測。通過與同時運行的 標準品進行比較來鑒定和定量氨基酸。盡管這是大多數蛋白質分析實驗室中常用的常規方法，但 是此方法也有缺點，就是對某些氨基酸分析不準確。含有酰胺鍵的氨基酸，比如天冬酰胺和谷氨 酰胺，會被轉換為相應的酸形式，天冬氨酸和谷氨酸，而無法最終單獨測定。一些其他的氨基酸， 比如絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸，會因為苛刻的降解條件而發生部分降解，因此無法 準確定量。一種氨基酸，色氨酸，會被常用的酸水解方法而破壞。

1.2 N 端和C 端序列分析

證明單克隆抗體具有正確的N 端和C 端是確認產品的一級結構以及確定是否存在不同形式 加工的抗體形式的另一種分析方法。C 端的賴氨酸變體和N 端的前導肽序列的不完全切割是單克 隆抗體產品常見的變異體，這種變異體可以通過N 端和C 端序列分析來檢測的。這些變異體是可 接受的，但是要進行檢測以確保在整個工藝開發過程中，不同規模的或者不同的生產工藝生產的 單克隆抗體產品批次之間的一致性。如果N 端沒有被谷氨酸殘基環化形成的焦谷氨酸封閉，那么 通?？梢允褂脴藴实腅dman 降解方法對完整單克隆抗體進行N 末端測序。通常要測定重鏈和輕 鏈的N 端5-10 個氨基酸殘基，并將所得的序列與單克隆抗體產品產物的預期序列進行比較。測定C 端的氨基酸序列則通常需要將蛋白質降解為小肽，然后對小肽進行測序，這里面即存在重鏈和 輕鏈的C 末端。通常作為整個單克隆抗體肽圖分析的一部分來進行。

相比于單條鏈的蛋白質，單克隆抗體產品中含有兩條蛋白鏈使得對序列數據的解釋更加困 難。另外，無法使用Edman 降解法對焦谷氨酸測序，因此通過該方法無法檢測到含有焦谷氨酸的 重鏈的N 端序列，但是可以在肽圖中確定C 端序列。重鏈序列的缺失不能證明焦谷氨酸的存在， 但這是最可能的原因。因此，N 端測序通常為定性檢測，以確認是否存在預期的序列，而不是對 每個存在的序列進行定量。在一些或者全部重鏈的N 端含有焦谷氨酸的情況下，可以通過肽圖分 析來確定N 端序列。

1.3 肽圖分析

如上面所講，肽圖分析可以用來確認單克隆抗體產品的一級結構，但是它也可以鑒定因降 解，比如脫酰胺或者氧化，而導致的單個氨基酸變化。肽圖分析還可以用于確定單克隆抗體產品 中二硫鍵的位置和糖基化位點。單克隆抗體產品的肽圖分析可以視為蛋白質的指紋圖譜，提供了 對該蛋白質的全面的理解。

當用于表征研究時，肽圖分析應確認至少包含了90%的蛋白質序列，單克隆抗體的肽圖分 析可能使用不止一種酶來消化蛋白質。與序列相關，單克隆抗體的某些部分可能無法被酶消化， 從而導致肽段太大而無法被鑒定。另外的部分也有可能被徹底消化成了單個氨基酸，這些氨基酸 在分離肽段的色譜中無法保留。翻譯后修飾的存在還可能是抗體的某些部分對酶消化產生抗性， 因此需要在消化和肽圖分析之前將蛋白質進行去糖基化處理。

1.4 游離的巰基和二硫鍵

在正常的條件下，IgG1 單克隆抗體含有四個鏈間二硫鍵，其中兩個將輕鏈與重鏈連接，兩 個將兩條重鏈彼此連接。其他IgG 的鏈間二硫鍵的數目略有不同，但是所有的IgG 均通過二硫鍵連 接在一起。在可變區和恒定區也會發現額外的鏈間二硫鍵，它們有助于穩定單克隆抗體的三維結 構。盡管單克隆抗體上所有的半胱氨酸殘基都應以二硫鍵配對，但是一個或多個二硫鍵還是可能 被還原，從而導致單克隆抗體產品中游離的巰基含量較低。這些游離的巰基可與另一個抗體分子 中的游離巰基反應，導致二聚化和多聚化，從而影響單克隆抗體此產品的穩定性。

單克隆抗體產品中的半胱氨酸殘基是否配對成二硫鍵可以通過在還原和非還原條件下產品 的肽圖分析來確定。將單克隆抗體去糖基化，去除蛋白質主鏈上的碳水化合物后，其中的一份樣 品用4- 乙烯基吡啶烷基化， 胰蛋白酶或者其他合適的酶消化， 經過HPLC 分離進行質譜分析 （LC/MS）檢測。另一份的樣品先用二硫蘇糖醇（DTT）還原，用4-乙烯基吡啶烷基化，用相同的 酶消化并通過LC / MS 分析。通過比較所得的兩個肽圖，可以鑒定出含有通過二硫鍵配對的半胱氨 酸殘基的肽段。對于單克隆抗體產品，含有許多的二硫鍵，通過還原前收集分離的肽段，可以更 容易的確定在二硫鍵中配對的半胱氨酸殘基。對還原和非還原兩種情況獲得肽圖分析，可以清楚 的確定哪個兩個半胱氨酸配對成了特定的二硫鍵。

正確折疊的單克隆抗體產品不應該存在游離的巰基?？梢酝ㄟ^使用Elman 試劑（DTNB）處 理單克隆抗體產品來確定產品中的游離巰基的存在程度。Elman 試劑與單克隆抗體中的游離巰基 反應，生成對硝基苯酚，該物質在412nm 處有非常強的吸收。在進行DTNB 處理之前，需要使用 溫和的變性劑處理來破壞單克隆抗體產品的三維結構，以將所有的游離的巰基暴露于Elman 試劑。反應結束后，測定在412nm 處的吸光度值，扣除412nm 處的背景吸收，然后除以13600（對硝基 苯酚的消光系數），以此來定量存在的游離巰基。Elman 試劑可以用許多其他的反應試劑來代替， 這些反應試劑都是特異的結合游離巰基，然后轉換為比色或者熒光測定，即使存在過量的未結合 試劑情況下仍可定量游離巰基含量。

1.5 內源性和激發性熒光色譜

內源性熒光光譜（IFS）可以提供有關單克隆抗體產品的三級結構的定量信息。在這個方法 中，蛋白質被近紫外到藍光波長的激光激發，可誘導單克隆抗體中的色氨酸殘基發出特征性的熒 光，這反映了每個色氨酸殘基周圍的微環境。單克隆抗體產品的固有熒光對蛋白質的三級結構 非常敏感，因為變性、降解或者聚集導致的三級結構變化都會導致固有熒光的最大波長或者強度 發生變化。因為三級結構與固有熒光之間沒有絕對的關系，因此不可能從熒光信息中得到抗體結 構的信息。但是，該方法在評估強制條件下蛋白質三級結構的變化中非常有用，并且經常用于分 析抗體的強制降解樣品，作為抗體產品穩定性研究的一部分工作。該方法可以用于制劑研究和對 生物類似藥的評估。

也可以通過使用與某些氨基酸（比如色氨酸）特異性結合的熒光探針來定量激發性熒光。但是探針的結合可能會破壞單克隆抗體的結構，因此還是傾向于使用內源性熒光測量作為研究單 克隆抗體三級/四級結構的方法。

1.6 核磁共振

核磁共振波譜（NMR）通過檢測原子核之間的相互作用來測定相互作用的結構信息。NMR 通過分析每個質子旋轉引起的磁化強度來提供蛋白質原子分辨率級別的結構信息。NMR 分析高度 依賴于技術和軟件，因此需要昂貴的設備和大量的計算機分析才能對數據進行反卷積，然后確定 哪些氨基酸側鏈對于抗體大分子的相互作用有影響。如果可以使用C13 或者N 標記抗體，則有助 于抗體的研究。蛋白質的標記通?？梢酝ㄟ^在富含這些同位素化合物的培養基中培養微生物來 實現。盡管NMR 不常用研究單克隆抗體的結構，但是可以用于研究抗體與目標分子之間的相互作 用。比較結合前后的NMR 光譜有助于確定哪些氨基酸側鏈是接近結合于結合區域的。

NMR 最大的優點是可以用于分析溶液中的蛋白質的結構，盡管溶液中蛋白質濃度要求要足 夠的高（0.05-1.0 mM）才能獲得有用的結果。這是一種非破壞性的方法，意味著樣品可以進行 二次分析。NMR 的分析結果可以快速獲得，盡管只是部分獲得，但是非常有用的。目前NMR 還 無法分析分子量大于40kDa 的蛋白質，因此通常用于分析小分子量的蛋白質。

1.7 質譜

質譜分析（MS）是通過多種方式在蛋白質上產生電荷，然后通過磁場和/或電場加速帶電 的蛋白質來分離抗體。蛋白質的加速度正比于其質荷比，然后在檢測器中被俘獲。蛋白質的電 離可以通過稀有氣體的原子轟擊（快速原子轟擊，FAB），激光電離（基質輔助激光解離，MALDI） 或者電噴霧電離（ESI）來實現。還有其他可以使抗體蛋白質帶電荷的方法，但是上述這些是最常 見的。帶電離子通過分析儀加速，通常是飛行時間（TOF）或者四級桿類型。飛行時間（TOF）質 譜儀是指可以在電場中加速帶電蛋白質，從而使每個具有相同電荷的分析具有相同的能量。分子 的飛行速度僅僅取決于蛋白質的質荷比。每種分析類型都有不同的適用范圍，適用于某些不同的 電離方法。比如，TOF 分析儀可以適用于ESI 或者MALDI，而四極桿分析儀則不適用于MALDI 電離 樣品。檢測器通常為光電倍增器或者電子倍增器。質譜儀的類型通常使用電離器和分析器類型來 描述，比如MALDI-TOF 質譜。檢測器記錄捕獲的帶電粒子，并根據加速模式來計算質荷比（m/z）， 通過合適的計算機軟件，就可以將其轉換為原始分子的質量。MS 可以和諸如高效液相色譜（HPLC） 之類的分離方法組合使用，先將樣品的組分進行分離，然后確定每種組分的分子量。之前，這種 方法費時又費力，限制了其實用性。但是，現代質譜儀以及配合其解釋結果而開發的軟件系統 使得該方法更易于使用，目前已經得到廣泛的應用。氫氘交換（HDX）功能標記和片段分離技術 可以與MS 結合使用用來鑒定蛋白質表面殘基。

質譜分析可以提供有關抗體分子量的準確信息，但是必須要注意選擇合適的方法來使蛋白 質離子化，并選擇加速離子化物質的條件。能量過高的電離可能會導致單克隆抗體分解為重 鏈和輕鏈，甚至有可能片段化抗體。質譜儀的輸出結果包含一系列的峰，代表了所檢測到的質量， 但是峰的高度與單獨的蛋白質的含量并不成比例，因此該方法無法提供定量檢測的結果。質譜圖 中的峰高與離子數量成正比，但是離子數量與蛋白質的離子化程度、離子化形式的穩定性以及通 過質譜儀加速的程度有關。為了能夠定量各種蛋白質，需要將MS 分析與輸出結果與蛋白質含量 成正比的方法，比如反相HPLC 結合使用。這種分離方法需要開發工作，以便使其適用于MS 檢測 以及大多數的HPLC 方法所用的UV 檢測。通常用于反相HPLC 的三氟乙酸不適用于MS 樣品，因此 需要開發其他的緩沖液系統。

除了確定抗體的完整分子量之外，還可以通過使用激發能使抗體片段化來獲得其序列的數 據。使用兩個直接連接的質譜儀（MS/MS），以足夠的能量來轟擊蛋白質，從而使抗體產生多個 蛋白質片段。這些片段被加速，然后單獨的片段再使用額外的能量轟擊產生二級片段，在第二個MS 中被加速和檢測。使用專門的軟件，可以通過檢查所檢測到的片段并發現哪些片段與已知單獨 氨基酸的分子量片段的區別來確定肽段序列。這些都可以足夠快的完成，以便可以在第二次激發 中檢測第一次激發中產生的大多數片段。當今MS/MS 設備的高質量和高靈敏度甚至可以提供有關 氧化或者脫酰胺以及一級結構方面的信息。

1.8 等電聚焦

上面描述的等電聚焦分析方法，如果不用于產品的放行檢測，則通常用于蛋白質的表征研 究。該技術具有非常高的分辨率，能夠分離僅有一個電荷差異的蛋白質至單獨的條帶中。因此， 該方法非常適合用于測定單克隆抗體產品的電荷異構體，還可以監測產品的脫酰胺、氧化和唾液 酸化程度。盡管該方法可以測定抗體的電荷異質性，但是沒有辦法來驗證異構化的位點，必 須與另一種方法，比如肽圖分析，結合使用來鑒定氧化或者脫酰胺的位點。

1.9 圓二色譜

圓二色性（CD）是一種光吸收現象，代表的是左右圓偏振光的差異吸收。圓二色譜（CD） 就是基于分子，比如抗體在遠紫外區域（190-250nm）或近紫外區域（230-250nm）影響左右偏振 光的方式的差異。這些差異的產生就是因為抗體，和所有的蛋白一樣，在結構上的不對稱性。單 克隆抗體，如果沒有有序的結構，則不會產生強度信號。有序的結構則可能產生正的或者負的CD 信號。從這些區域的CD 光譜上獲得的信息是不同的。遠紫外CD 對二級結構更為敏感，而近紫外CD 光譜對三級結構更為敏感。

CD 可以用于測定蛋白質的二級結構。通?？梢杂糜诖_定折疊或者突變對蛋白質的影響以 及用來研究蛋白質之間相互作用。在遠紫外區域，α-螺旋，β-折疊或無規卷曲通常具有良好并且 獨特的CD 光譜。單克隆抗體產品在遠紫外區域的CD 光譜則反映了蛋白質結構中的每個光譜所代 表的蛋白結構的數量。該方法還可以用于評估抗體微環境的改變如何影響其二級結構。這些微環 境可包括不同的緩沖液pH 或者溶液的滲透壓。與遠紫外CD 不同，近紫外CD 光譜與特定的蛋白 結構之間沒有直接的關聯。近紫外CD 光譜區域取決于芳香族氨基酸，比如酪氨酸、苯丙氨酸和色 氨酸、半胱氨酸的吸收和其微環境。CD 一般不常用于放行測試，但是CD 可用于比較不同批次的 單克隆抗體的二級結構，還可以用于制劑處方和制劑工藝的開發。

CD 是一種樣品無損的分析技術，可以對樣品進行再分析。它要求樣品的濃度要稍高，如0.5-1.0mg/ml。CD 可以快速的獲得結果，并且可以在各種條件下，比如不同的pH 和溫度下進行研究。單克隆抗體產品的分析很大程度上依賴于已知結構的蛋白衍生的參照光譜的經驗，因此， 一個成功的CD 分析是取決于所使用的參考數據庫的。

1.10 傅立葉變換紅外光譜

傅里葉紅外光譜（FTIR）也是用于分析蛋白質的二級結構的。紅外光譜法測量入射能量與 分子內的電偶極相互作用時在特定能量下吸收的入射紅外輻射（0.78-1000um)。FTIR 依賴于紅 外光譜學基礎，也就是蛋白質二級結構與相關紅外波段條帶之間的關系。FTIR 儀器與先進的數學分析方法相結合，可以分離重疊的IR 波段。FTIR 提供了有關抗體蛋白高度結構化區域，比如α螺 旋或β折疊的存在和相對數量的信息。結構化區域影響抗體的酰胺鍵區域的紅外光譜的吸收。通過 對已知二級結構含量的蛋白質的研究結構分析，可以將FTIR 數據與各種結構域的含量相關聯。FTIR 相對于其他檢測二級結構的分析方法一個優勢是它對固體制劑的適用性。該方法還可以應用 于凍干或者噴霧干燥的樣品來評估多種制劑處方。

1.11 多角度激光散射

多角度激光散射（MALLS）提供了有關單克隆抗體產品聚集體和降解體的數量和性質的信 息。對于聚合物，比如PEG 偶聯的抗體，MALLS 也可以很好的估計其真實大小，而SDS-PAGE 或者SEC 是不能看到的。

1.12 差示量熱掃描

單克隆抗體也可以通過差示量熱掃描方法（DSC）來進行表征研究。與FTIR 類似，DSC 提 供的是有關抗體熱穩定性的信息。通過測定影響樣品相變所需的能量，DSC 提供了有關不同制劑 中的單克隆抗體的比較信息。折疊成熱力學最穩定結構的單克隆抗體要比結構不穩定程度高或者 具有不穩定的三級/四級結構的抗體需要更多的能量來展開。相變溫度（Tm），也就是樣品中50% 的分子未折疊點的溫度是產品三級結構穩定性的函數。單克隆抗體的折疊和解折疊發生在分子中 的多個位置，從而導致會有多個熱轉變點。由于單克隆抗體產品的Tm 可能會受到產品所用的制 劑的影響，因此DSC 也可以作為篩選和優化單克隆抗體產品制劑處方的重要工具。

1.13 表征蛋白結構的其他分析方法

盡管在臨床I 期之間很少使用，但是還是有其他的幾種分光光度法可以用于表征單克隆抗 體產品。測定UV 光譜的二階導數可以提供有關抗體純度的信息。FTIR 和CD 可以提供有關抗體的 二級結構的信息。每種單克隆抗體的芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）的含量可能不 同，從而導致該抗體在近紫外區域（250-350nm）內的特征光譜有所不同。通過測定光譜的二階 導數，可以確定該光譜是由于單個純分子還是兩個或者多個光譜組合的結果，從而表明是否存在 雜質。

另一種常見的降解途徑是天冬酰胺的脫酰胺，可以通過市售的試劑盒來測定48 。該方法確 定異天冬氨酸的含量主要是基于當異天冬氨酸與異麥芽糖基甲基轉移酶（PIMT）一起時可以酶促 催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉化為S-腺苷高半胱氨酸（SAH）。SAH 的含量即等于轉化的異天冬 氨酸的含量，然后通過HPLC 進行分離和檢測。通過與同時運行的標準曲線來確定SAH 的濃度。該 方法適用于定量天冬酰胺的脫酰胺含量，因為異天冬氨酸主要通過脫酰胺產生。不過要注意的是， 由于溶液的pH 和周圍的氨基酸序列可能會影響生成的異天冬氨酸和天冬氨酸的比例。

2 聚集體的表征

單克隆抗體產品原液和制劑中的聚集體是影響產品活性和安全性的關鍵質量屬性。上文討 論的尺寸排阻色譜法和SDS-PAGE 可用于常規的檢測單克隆抗體聚集體。為了更詳細的表征單克隆 抗體產品，精細的分析方法，比如多角度激光散射（MALLS）、分析型超速離心（AUC）和非 對稱快速超濾（FFF）等，則可以使用。

MALLS 利用的溶液中的蛋白質對已知光散射的行為。以光源為直線，從零角度散射的光量 與溶液中的蛋白質的質量成正比。零角度光因為被光源淹沒，無法測量，因此MALLS 儀器測量的 是一定角度（＞3）散射的光，并使用此數據來計算溶液中分子的平均分子量。該方法能夠在單一 溶液中鑒定出多種不同分子量的分子，因此不需要事先使用SEC 來分離抗體。MALLS 也可以用于 確定從SEC 分離出的峰上分子量，這就可以提供有關分離的高分子量形式的分子是二聚體、三聚 體還是多聚體形式的信息。為了獲得有關單克隆抗體聚集體形式的性質和數量的最多信息， 將SEC 與UV 和 MALLS 檢測結合使用既可以定量蛋白質的峰，又可以鑒定出每個峰中的分子的分子量 信息。

AUC 是基于蛋白質或者其他聚合物在離心場中通過梯度溶液的遷移率來分析。該遷移率是 所研究抗體的分子半徑的函數。盡管AUC 不適合于質量控制，而且由于其精度差而易于驗證，但 是在確定單克隆抗體及其相關產品形式的分子量時，AUC 仍是一個金標準，同時也可以用于確定 抗體的結合常數。AUC 數據分析的前提是基于單克隆抗體產品分子半徑與其分子量時直接相關的。只需要少量的樣品，AUC 即可分析共價和非共價的聚集體。盡管可以確定較大的分子量范圍，但 是在高濃度抗體溶液中，AUC 的檢測并不是特別理想，因此需要稀釋樣品，這可能會導致可逆聚 集體的解離。AUC 數據的分析需要專門的軟件將沉降速率轉換為分子量信息，而對數據的解釋則 需要專門的人員培訓。

非對稱快速超濾也可以同時分析出共價和非共價的聚集體。FFF 分離是通過施加垂直于樣 品通過狹窄通道的流場將溶質分層固定在膜上來實現。分子沿著流動路徑的運動是所分離的分子 的分子量的函數。由于沒有柱分離，因此該方法不能分離非常大的分子，并且難以看到0.15um 范 圍內的聚集體和顆粒 73 。與AUC 一樣，該方法的精密度較差，難以驗證，不適合QC 使用。樣品 與膜之間的相互作用現在尚未有很好的理解和控制，可能是導致結果不準確的原因。

3 糖型的表征

單克隆抗體產品表征的一個關鍵部分是確定分子中的碳水化合物含量，包括單糖的數量和 類型，確定蛋白質上碳水化合物鏈的定位以及單克隆抗體上存在的各種聚糖的寡糖模式，確定每 個糖鏈結構中末端存在的唾液酸含量和類型。確定單克隆抗體產品上存在的寡糖是N 糖或者O 糖也非常重要。哺乳動物細胞生產的單克隆抗體通常在每條重鏈的CH2 區域的Asn297 上存在 一個N-連接的糖鏈結構，但是，這種糖基化的程度會因為不同的生產細胞系而變化，并且可能取 決于用于生產單克隆抗體產品的培養條件。此外，CHO 細胞還可以在單克隆抗體上引入人抗體上 不存在的糖或者糖鏈，從而產生非活性或者具有免疫源性的產物。在單克隆抗體產品的其他天 冬酰胺殘基上也會發現類似的N-連接糖鏈。比如， 目前批準的單克隆抗體產品，如西妥昔單抗 （Erbitux）約有15-20%的VH 區域的Asn88 上具有N-連接的糖基化。由于抗體糖基化是生產過 程中批間差異的主要原因，監管機構要求全面表征單克隆抗體產品的糖基化性質和程度。

單克隆抗體產品的完整糖基化表征包括分析分子中每一個潛在糖基化位點的百分比以及確 定不同的寡糖的結構。如上所述，肽圖分析可以用于鑒定單克隆抗體產品中的糖基化位點以及位 點的占用比例。利用MS/MS 或者N 端測序分析對肽圖分析中釋放的肽段進行分析，可以鑒定出產 物中每個糖基化位點的確切位置。每個位點的占有率則可以通過測定含有糖基化位點的肽段在有 或者沒有糖鏈的情況下的相對含量來確定。進行此類分析時，需要注意確保糖鏈的存在不會對蛋白質的消化降解產生影響。通過對釋放的每種肽段進行測序，可以在某種程度上補償這種情況， 從而可以鑒定出切割位點的差異。

描述每一個糖基化位點的寡糖結構可能會比較復雜，因為每個糖型結構可能包含不同的含 量的唾液酸，可能存在雙觸角或者三觸角形式，也可能被巖藻糖化等。確定每種糖型的結構首先 使用PNGaseF 從單克隆抗體上切割下完整的寡糖，然后通過HPLC 分離不同的寡糖結構，使用一種 或者多種方法進行測定。每個寡糖的結構信息可以通過將樣品的洗脫時間與在相同色譜條件下同 時運行的一系列標準寡糖進行比較來確定?；蛘呖梢酝ㄟ^質譜法來確定寡糖的結構，類似于單克 隆抗體產物的肽鏈上的氨基酸測序。將此方法確定的測序數據與先前確定的單糖組成數據相結合， 可以確保序列的準確性。

4 亞可見顆粒的定量

單克隆抗體產品中存在的潛在顆粒的數量和大小對產品的一致性和安全性至關重要，尤其 是隨著FDA 越來越關注尺寸小于10um 的顆粒。在這個尺寸范圍內，藥典上用于測量顆粒的方法 （USP <788>和EP 2.9.19）準確性要稍差。盡管尚無監管機構期望控制此尺寸范圍的顆粒物，但是 已經開始要求企業要確定此尺寸范圍內的顆粒物的濃度并匯報結果。當前藥典方法測定這些小顆 粒時的不準確性，還需要在測定中應用其他的分析方法。新方法可包括圖像分析、激光衍射和 偏振強度衍射分析（PID）。圖像分析可以捕獲懸浮在溶液中的顆粒經過感應區域時的圖像。圖像 分析軟件可以確定顆粒的濃度和大小。激光衍射分析基于與MALLS 相同的原理。入射光的微分散 射是溶液中顆粒大小的函數。偏振強度衍射也是使用光的微分衍射作為顆粒大小的函數關系來分 析，但是入射光在垂直和水平兩個方向上偏振，并且在多個波長下測定散射光以增加所獲得信息。目前，這些方法都不適合在QC 實驗室中實施，但是每種方法都可以提供有關單克隆抗體產品中存 在的亞可見（≤10um）的微粒的大小和濃度的信息。