單克隆抗體（單抗）藥物已經成為市場上增長最快的一類治療藥物，但開發用于治療的單抗仍然具有挑戰性。此文從制劑開發角度，根據單抗序列分析、高通量實驗性評估綜述了單抗藥物早期成藥性研究策略，旨在為篩選鑒定出易于生產及穩定的候選治療性單抗藥物提供參考。
自1986年全球首個單克隆抗體(單抗)藥物OKT3問市以來，單抗就在生物制藥中占有重要地位，并逐漸成為生物醫藥領域發展的主要方向，長期占據全球“超級重磅炸彈”藥物榜單，在癌癥、自身免疫性疾病和病毒感染治療等領域應用廣泛[1-2]。分離高效、廣譜人源化單抗方法的出現，使我們能夠開發出高活性的抗體藥物[3]。
在單抗藥物開發早期，能及時識別出影響單抗藥物成藥性的指標是非常重要的[4]。前期需要對病毒靶點進行篩選，對選出的靶點進行抗體庫的構建，通過活性的篩選，得到抗體的可變區序列，對序列進行分析，選取等電點（isoelectric point，pI）合適、翻譯后修飾（post-translational modification，PTM）少的序列，進行瞬時表達獲得一部分抗體，然后進行進一步的體外生物學活性分析，包括抗原-抗體結合活性、病毒中和活性、阻斷活性等，篩選出目標分子，必要的時候可引入體內藥效評估。另外抗體能夠被開發成藥，還需具備一定的溶解度和穩定性，兩者均屬于抗體制劑開發角度的成藥性研究范疇。在早期候選單抗分子篩選過程中需從生物制劑開發的角度對單抗的成藥性進行綜合評價，以提高后期候選單抗開發成功的可能性。
早期成藥性評價是從已知單抗的序列出發，評估候選單抗的互補決定區（complementarity determining region，CDR）中潛在的 PTM 位點對未來藥物安全性、有效性以及生產工藝產生的影響，而高通量試驗性評估主要通過試驗對單抗的膠體穩定性、構象穩定性和血清穩定性等進行評估。本文對抗體藥物開發成藥性進行介紹，以期為單抗藥物開發提供借鑒。
1、單抗序列分析
在獲得單抗序列后，應首先進行序列分析，包括pI、PTM位點等，以進行初步的成藥性評估[5]。選擇pI易于進行生產工藝開發的、PTM位點較少的序列，必要時可對高風險氨基酸位點進行點突變（如將Asn殘基突變為Gln以防止糖基化），以減少后期制劑開發過程中可能會面臨的問題[6]。
1.1pI預測
一般根據氨基酸序列，可以通過計算機模擬的方式估算出單抗的pI。pI對基于細胞表達的單抗的后期純化工藝和制劑處方開發影響較大，而且抗體分子帶電性的變化可影響其在體內與細胞表面受體識別與結合，從而影響抗體在組織、血清中的分布和代謝特征，因此對候選單抗的pI進行預測很重要。pI低的抗體藥物，組織攝取時間增加，清除率降低，體內半衰期延長，清除率與pI呈正相關[7-10]?；诎被嵝蛄杏嬎愠龅膯慰估碚損I和實測值有時會有差距，這是因為一些PTM（如糖基化、磷酸化、甲基化等）、可變剪切以及蛋白降解等會影響單抗的pI。有研究對9個單抗的理論預測pI和實驗測得的pI進行了比較,相差可達±1[11]。我們也對2株抗新型冠狀病毒單抗X和Y的理論pI和實測pI進行了比較，根據單抗序列查詢可知：X的理論pI為8.46，Y的理論pI為8.32，2株單抗的pI實測值X為8.35、Y為8.39，理論值與實測值相差分別為0.11和-0.07，均在±1的范圍內，理論值可滿足早期成藥性評估的需求。因此，在早期成藥性評價時，基于序列進行pI理論預測是可行的。從成藥性角度對已上市的抗體分子pI進行統計分析，發現大多數抗體類分子pI高于7.5。為了降低抗體純化、開發的難度，同時結合抗體在一定pH范圍內遠離pI的pH條件下，能保證較高的溶解度和減少聚集的特性，候選單抗分子的pI還應遠離生理條件的pH，以降低生產、給藥風險。
1.2PTM
蛋白質前體在PTM之前是沒有活性的，只有在進行進一步的PTM加工和處理后，才會具有相應的生物學功能。單抗的PTM影響著抗體的正確折疊、空間構象和功能結構。PTM是一個復雜的過程，比較常見的為糖基化、二硫鍵形成、脫酰胺、氧化、甲基化、磷酸化等。通過對候選單抗CDR的氨基酸序列進行分析，尋找出潛在的PTM位點，并對可能影響單抗生產、制劑開發、穩定性以及生物學活性的位點進行風險評估。在PTM分析過程中，應首先對各個抗體序列進行計算分析，以判斷是否存在游離Cys和N-連接糖基化位點，然后進一步分析脫酰胺位點和異構化位點，必要的時候還應通過基因工程手段進行改造，以滿足單抗成藥性的要求。
1.2.1 糖基化修飾 抗體分子是一種糖蛋白，糖基化對抗體的生物學功能是十分必要的[12]。糖基化是抗體藥物關鍵質量屬性之一，糖基化修飾對抗體的療效、安全性以及藥物代謝動力學等方面有著巨大的影響。糖鏈通常修飾于抗體分子Fc段CH2亞結構域上，全人源或人源化的IgG單抗N-糖基化修飾位點位于CH2區297位Asn上，該基序為Asn-Xaa-Ser/Thr（Xaa為除Pro外的所有氨基酸殘基）。也有少數N-糖基化位點位于抗體Fab段亞結構域中[13]。除N-連接的糖基化外，極少數單抗藥物中也存在O-連接的糖基化。O-糖基化多發生在臨近Pro的Ser或Thr殘基上，位點處的蛋白質多為β構型。基于抗體分子氨基酸序列的一級結構，即可推測潛在的糖基化位點。盡管并不是所有這些位點在生產時均會被糖基化，但后期生產過程中仍然可能改變這些位點的暴露狀態，繼而改變糖基化狀態，從而影響其結合活性和藥代動力學特性。已有研究表明，帶有高甘露糖型聚糖的IgG在血清中的半衰期較短[14]。在CH3結構域中被額外糖修飾的IgG能夠更有效地與新生兒Fc受體結合，從而延長半衰期[15]。Fc區聚糖可以通過改變Fc區的構象或通過聚糖-聚糖相互作用直接影響IgG與Fcγ受體的親和力，從而強烈影響其招募免疫效應細胞的能力[16-18]。另有研究表明，Fc區糖基化有助于維持分子的穩定性，酶切截斷或去除Fc聚糖的IgG顯示出熱穩定性、補體結合能力和細胞依賴性細胞毒性效應降低[19-20]。因此，在早期成藥性評價中，研究、調整和控制單抗藥物的糖基化水平顯得十分重要。
1.2.2 二硫鍵配對分析 巰基在體內會形成二硫鍵，二硫鍵在單抗的熱力學穩定性和正確折疊中起著非常重要的作用。一般而言，單抗具有4對鏈間二硫鍵和12對鏈內二硫鍵，用來維持單抗結構的穩定性，以抵抗各種有害影響。但單抗由于本身結構的復雜性，并不是所有的Cys都會形成二硫鍵，因此會造成Cys在體內的錯配，準確預測二硫鍵對于確定單抗的理化特性至關重要。二硫鍵的存在和形成機制可以通過分析單抗的分子結構或通過水解消化，然后進行基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜分析預測[21]；也可以基于氨基酸組成對二硫鍵的預測，預測模型計算每個Cys對之間的距離，并且根據在閾值內的距離，預測1對Cys形成二硫鍵的可能性[22]。
1.2.3 脫酰胺和異構化 Asn脫酰胺和Asp異構化是單抗藥物最常見的2種降解途徑。脫酰胺會導致單抗活性損失，使蛋白質局部疏水性發生變化，影響單抗的空間結構，降低活性，改變生物功能，影響代謝。單抗中Asn和Gln會發生非酶催化的脫酰胺，生成Asp和Glu，其中Asn更普遍，通常發生的位點為：Asn-Gly、Asn-Ser、Asp-Gly。約 70% 的脫酰胺會產生Asp的異構化，異構化的位點主要包括Asp-Gly/Ser/Asp，在pH<6且溫度較高時更易發生，脫酰胺單抗會形成酸性峰，且該反應在單抗的長期儲存過程中也有可能發生，在pH >7環境中的發生速率很快，這些具體位點的鑒定可通過肽圖-質譜來確認。如果CDR的Asp殘基后面是Gly、His或Ser殘基，通常易于異構化[23-25]。異構化可能導致抗原結合親和力降低[25-26]。因此，在進行抗體生物信息學評估時，需要關注CDR的Asn殘基以及Asn-Gly殘基，并在強制降解階段對其進行評估。
1.2.4 氧化 單抗序列中Trp或Met的氧化是單抗分子的另一個重要化學降解反應。造成單抗氧化的活性氧可能來自細胞培養基、設備中的金屬離子、制劑中添加的吐溫和保存運輸過程中的光照等。單抗氧化除了可能會造成活性喪失，還可能引起聚集體形成，甚至產品變色[27]。但并不是序列中所有Trp和Met都會氧化，只有暴露在溶劑環境中的位點才會發生，因此對單抗氧化位點的預測需結合單抗高級結構進行模擬計算。Yang等[28]對處于臨床階段的121個抗體進行了表面Met氧化位點的預測，同時也采用過氧化氫處理這些抗體，強制其氧化，并應用質譜對氧化位點進行了逐一鑒定，結果顯示模擬預測和實際實驗結果有很好的相關性。
2、單抗成藥性高通量實驗性評估
早期受限于可獲得的單抗樣品量，通常采用高通量的方式進行篩選，主要包括對溶解度、構象穩定性、血清穩定性以及物理穩定性等進行分析。
2.1溶解度
單抗在溶液中會有蛋白質-蛋白質間相互作用，這種作用力主要由分子表面的疏水基團和電荷分布決定。當相互作用力表現為排斥力時，溶液就會表現出相對較好的膠體穩定性，當相互作用表現為吸引力時，就會產生聚集甚至沉淀，此即為單抗的膠體穩定性。膠體穩定性直觀地反映了單抗的溶解度，溶解度是單抗生產開發的重要條件，在足夠高的濃度（>100 mg/ml）下獲得可溶性單抗的穩定配方仍然是一個主要挑戰[29]。據估計，超過90%的潛在蛋白藥物由于溶解度低而不適合開發[30]。為了提高依賴單抗溶解度的產品的成功概率，常用的策略包括避免潛在的困難目標，專注于提供更好的高溶解度的單抗，或優化單抗的制劑配方以提高溶解度。有許多方法可用于溶解度的測量，包括采用超濾膜濃縮單抗溶液，直到觀察到相變（沉淀或其他固體形式），或將凍干單抗粉溶解到高濃度溶液中，以及基于靜態光散射技術得到的第二維里系數和基于動態光散射技術得到的擴散相互作用指數，均可用于指示單抗分子間作用力大小。盡管有很多方法可以用來測定蛋白質的溶解度，但在新藥開發過程的早期階段，單抗的可獲得性可能是一個限制因素。因此，采用高通量的方法預測單抗溶解度的能力將對候選單抗的選擇和后期配方開發極為有利。
研究表明，蛋白質溶解度與溶液中聚乙二醇的質量百分比之間存在對數線性關系[31-32]。聚乙二醇誘導單抗沉淀的方法是基于液-液分離現象，如果抗體溶液會產生液-液分離，那么結晶及膠體聚集就會存在，以此來評價單抗的表觀溶解度。值得注意的是，表觀溶解度僅表示在含有聚乙二醇的溶液條件下，根據上清液中蛋白質的濃度推斷出的蛋白質在無聚乙二醇時的溶解度。雖然表觀溶解度不是單抗的實際溶解度，但在單抗早期篩選過程中，作為一種快速、高效、所需樣品量少的研究方法，有助于在開展耗時和昂貴的單抗開發過程之前排除具有潛在溶解度和外觀問題的單抗。
2.2構象穩定性
單抗構象穩定性研究中，不同的結構域表現出的穩定性不同，其中最不穩定的結構域決定了整個蛋白分子的穩定性。在所有的人Ig制劑中IgG1和IgG2亞型約占總量的90%[33]，這2種亞型的CH2區最不穩定，易發生去折疊，該區主要為β折疊，含有較多芳香族氨基酸殘基，熒光染料與其結合可產生較強的熒光[34]。目前用于構象穩定性研究的方法有圓二色譜法（circular dichroism，CD）、差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）、差示掃描熒光法（differential scanning fluorescence，DSF）等。CD是通過升溫過程中，掃描單抗分子中暴露的手性基團來監測結構和構象的變化。DSC則是根據蛋白質在解折疊的過程中會吸收熱量，通過記錄熱量的變化來測定單抗的熔融溫度（melting temperature，Tm）。DSF與DSC方法過程類似，是根據單抗解折疊過程中疏水基團暴露后與熒光染料結合，通過監測熒光染料的變化而測定單抗的Tm。雖然DSC法與DSF法測定蛋白結構域去折疊溫度的原理不同，但DSC法及DSF法測得的Tm值均表征人Ig CH2區的構象變化，具有較好的一致性；并且DSF方法在測定過程中樣品用量少，僅需20~25 μl樣品，可在2 h內同時測定30種以上單抗樣品的結構穩定性。就早期成藥性研究而言，建議采用DSF方法進行結構穩定性評估。有研究發現，Tm與細胞培養表達量有高度的相關性。Tm值越高，蛋白構象越穩定，往往表達量也越高[35]。近期1項對處于臨床階段的137個單抗各種理化性質的聚類統計分析也表明，瞬時表達量與Tm高度相關[36]。這可能與單抗的構象穩定性有關，穩定性好的蛋白質容易迅速折疊分泌至胞外，而不穩定的蛋白質則會在細胞內蓄積，形成細胞毒性而造成細胞活率下降。因此，Tm值也成為早期成藥性評價中的常用指標。
2.3血清穩定性
在膠體穩定性和構象穩定性研究的基礎上，通過進一步的血清穩定性來初步判斷單抗的半衰期，同時為給藥劑量的確定提供基礎，是單抗開發早期藥代動力學研究的一個重要方面，也是評估藥物能否進行下一步開發的重要依據。血清穩定性通常分為體內血清穩定性和體外血清穩定性。體內血清穩定性檢測多采用小鼠或大鼠等實驗動物為研究對象，檢測給藥后血藥濃度的變化。體外血清穩定性檢測則是在體外采用健康AB血型男性的血清進行試驗，觀察單抗在血清中的穩定性[37]。體內血清穩定性檢測往往所需樣品量大、時間長，而體外血清穩定性檢測通常在48 h內可以得出結果，對于早期成藥性篩選而言，體外血清穩定性檢測更方便、快捷。
2.4物理穩定性
與上述幾種穩定性研究方法不同，物理穩定性研究所需樣品量大、耗時長，不屬于高通量的方法，但它能直觀地反映單抗的穩定性且能用于推測單抗的長期穩定性，在篩選出初步的單抗序列后有必要進行40 °C、2周的物理穩定性研究。在40 °C條件下評估聚集、電荷異質性和修飾，方法包括分子排阻色譜、毛細管電泳、動態光散射和濁度測量等，并根據需要通過質譜法對降解產物進行詳細表征。
3、總結
單抗早期成藥性評估過程旨在從開發初期就鑒定出具有生物學活性、易于生產及穩定的治療性單抗候選分子。一個新的單抗從早期序列篩選、生產工程細胞株構建，再到細胞規?；囵B、純化、制劑、檢定方法開發及臨床研究，需經歷一個較長的研發過程和巨大的資金投入，因此為了降低后期開發的風險，前期對候選抗體分子進行各項可開發性評估至關重要。
本文提到的序列分析預測是早期序列選取過程中需要考慮的問題，由于各項預測均基于模擬的計算方法所得，因此任何一項結果指示出的單抗不理想性質，并不足以直接否定該單抗分子成功商業化的可能性。但一個單抗分子所表現出的不理想指標越多，意味著后期失敗的風險越大，因此，需要對所有評價方法得到的結果進行綜合評估，且在獲得單抗樣品后應及時采用實驗的方法（如質譜）對PTM進行確認，以保證選取序列的后期可開發性。
單抗篩選過程中，在生物學活性鑒定的基礎上，結合處方前研究工作，對篩選出的優選分子進行進一步評價和優化，則是單抗藥物發現中更有效率、成功率也更高的一種成藥性評價策略。通過高通量實驗對單抗分子開發過程中的溶解度、穩定性等指標進行快速有效的評估，以發現后期培養、純化、制劑開發過程中可能面臨的問題，并在前期篩選過程中進行綜合考量，最終選取活性高、穩定性好的單抗進行后期開發，可以極大地降低開發風險，與僅基于生物活性的鑒定相比，良好的開發性策略可幫助選取成藥性更高的分子。
引用本文：杜洪橋, 吳小麗, 黃仕和. 基于制劑開發的單克隆抗體藥物早期成藥性研究策略 [J]. 國際生物制品學雜志, 2023, 46(2):109-114.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220823-00054
